郫县豆瓣高酶活米曲霉选育鉴定及复合菌制曲改善酶系组成研究——郫县豆瓣高酶活米曲霉的选育鉴定

李 峰，赵 萍，周昌豹，宋 萍，张蓓蓓

（四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都 611130）

郫县豆瓣是我国传统特色发酵食品的典型代表，历史悠久，为中华传统生物食品产业之瑰宝，是源自中国本土的生物技术产业，是全国著名的地理标志产品。郫县豆瓣因红润光亮、酱香浓郁、味辣香醇、瓣粒酥脆、黏稠绒实等优点受到消费者青睐，堪称川菜之魂。其依赖四川优越的气候、地理、环境、人文、饮食条件及独创性的生产技艺，历经300多年的演变、沉淀、锤炼、升华，自成一家、长盛不衰，深受国内外消费者喜爱和同行的广泛关注与认同。非物质文化遗产郫县豆瓣于2000 年4 月21 日获得国家工商总局商标局批准的“郫县豆瓣”地理标志证明商标，并获得中国驰名商标等荣誉称号。目前郫县豆瓣从传统的烹饪调料发展到系列复合调味品：火锅底料、烧菜调料、鱼调料、饭扫光、佐料系列等新产品，销售遍布全国各省、市，并出口美国、加拿大、新西兰、日本等国家。

1 材料和试剂

豆瓣样品：从郫县豆瓣生产企业采集样品。

培养基：菌落分离采用PDA培养基；菌种鉴定采用察氏培养基。

PDA培养基：马铃薯削皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000mL，pH值自然，121℃菌20min。

察氏培养基：硝酸钠3g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

固体培养基：按照麸皮:豆粕为4:1的比例混匀，并加入干料量75%（v/w）的水，拌匀。121℃、0.1 MPa灭菌45min。

主要试剂：福林试剂（Folin试剂）、二硝基水杨酸（DNS）试剂均为实验室自配、Tris-HCl，EDTA，PCR扩增产物纯化试剂盒等；蚕豆、麸皮、豆粕均购自农贸市场；其他试剂均购自成都百旺化学试剂公司。

2 仪器和设备

主要仪器：752型紫外可见分光光度计，HH-600（0）型电子恒温水浴锅，LXJ-II离心沉淀机，PHS-3C型精密pH计，LRH-250A型生化培养箱，XS-18型光学显微镜，Bio-rad PCR仪，Thermo小型离心机，电泳仪，摇床，超净工作台。

3 实验内容和方法

3.1 米曲霉的分离纯化

无菌条件下，将曲捣碎，称取适量样品，选取适宜的稀释度用生理盐水稀释，采用含青霉素100单位/mL的PDA培养基，采用稀释涂布平板法。每个稀释接种3个平板，放置于30℃的培养箱内培养至48h，进行观察，将菌落形态不同的菌种分离，各自传代培养，至少进行3次传代分离，得到纯化菌种，保存菌种备用。

3.2 高酶活米曲霉的筛选

将纯化好的单个菌株接入到固体发酵培养基中，按照麸皮:豆粕为4:1的比例混匀，并加入干料量75%（v/w）的水，拌匀。121℃、0.1MPa灭菌45min，冷却后分别接入菌种，在30℃恒温培养72h。以酸性蛋白酶、中性蛋白酶和淀粉酶活力作为复筛的标准，筛选出酶活相对较高的米曲霉菌株。

3.3 菌种鉴定

对筛选出的菌株采用划线平板培养后进行培养特征的观察。菌体特征及孢子结构观察从菌落上挑取菌丝及产孢结构，制普通玻片进行光学显微镜观察；根据筛选菌株的菌落、菌丝、抱子形态显微镜照片特性进行鉴定。

3.4 酶活力测定

3.4.1 蛋白酶测定方法

粗酶液制取方法：上述制得固体曲样品中按重量加入1:20（w/v）的缓冲溶液，于40℃水浴中浸提1h，间歇搅拌，过滤得粗酶液。此粗酶液用于各种蛋白酶酶活性测定。

酶活测定方法：采用福林酚法。

3.4.2 淀粉酶测定

样品处理：酶液提取方法同蛋白酶测定，取5mL粗酶液，在7000r/min离心30min，吸取上清液测定酶活性。

酶活测定方法：参照SOMOGYI M的方法进行测定。

3.5 菌株DNA的提取

（1）取适量菌丝，加入500mL 5×CTAB，再加适量的玻璃珠，漩涡振荡器上高速振荡4min～5min。

（2）65℃保温20min，每隔10min摇匀1次。

（3）加入等体积氯仿:异戊醇（24:1，v/v），12000r/min离心10min。

将上清液移入新的离心管中，重复此步骤。

（4）在上清中加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃静置20min～30min，12000r/min离心10min。

（5）倒掉上清，加70%vol的酒精200mL洗沉淀，室温干燥。

（6）加入100mL TE使DNA完全溶解；加入RNase A（10mg/mL），65℃保温30min。

（7）重复步骤4～6。最后DNA 溶于30mL超纯水。

3.6 PCR扩增

根据真菌整个ITS区设计通用引物序列为：

正向引物：ITS4：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’反向引物：ITS5：5‘-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，以霉菌的DNA基因组为模板，扩增ITS序列。

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min，进行35个循环，最后72℃延伸10min。

3.7 PCR产物的电泳

进行1%的琼脂糖凝胶电泳。90V电压条件下，电泳40min。

4 结果分析

4.1 酶活力测定

将筛选出的菌种ddQ-125和jcQ-93进行蛋白酶活力和淀粉酶活力测定，对照菌是市售曲精C结果见图1。

图1 米曲霉菌种的酶活力Fig.1 Enzyme activity of the Aspergillus oryzae strain

由图1可知，菌株ddQ-125酸性蛋白酶活力最强，菌株jcQ-93的中性蛋白酶和淀粉酶的酶活力较菌株最强，酶活力均高于对照市售曲精C。

4.2 菌种的形态学观察

经平板筛选和分离纯化，从郫县豆瓣生产企业收集样品中分离筛选出2株霉菌，编号为ddQ-125和jcQ-93。

图2 菌种的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of strains

菌株ddQ-125和jcQ-93的菌落、菌丝和抱子形态如图2，在PDA培养基上，25℃培养7d，产出黄色或黄绿色孢子，菌落表面絮状、边缘白色绒毛状。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成黄绿色或黄褐色。背面无色或中央略带黄褐色。分生抱子梗自基质中伸出，分生孢子穗半圆形，小梗1层或2层；顶囊半球形、圆拱形以至球形；分生孢子球形。通过形态和显微观查结果，初步鉴定这两株菌为米曲霉。

4.3 PCR反应结果

将反应后的PCR产物于1.0%琼脂糖缓冲系统，90V电压条件下，电泳40min，用凝胶成像系统观察并摄影记录。所有菌株都产生单一的明亮条带，且所有的条带均为所需条带的长度，正好为目的片段的长度，见图3。

图3 菌株ddQ-125和jcQ-93的rDNA-ITS部分序列的PCR扩增电泳图Fig.3 Electropherogram of strain ddQ-125 and jcQ-93 partial sequences of rDNA-ITS PCR amplification

4.4 菌株的ITS序列分析

4.4.1 ddQ-125菌株扩增ITS部分基因序列

CGAAGGACATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAG CCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTG TACCTTAGTT G CTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGG GCTCTCAGCCCCGGGC CCGCGCCCGCCGGAGACA CCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTT GATTGTA TCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATG GATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGC GAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCG TGAATCATCGAGTCTTTGAACG CACATTGCGCCCC CTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCA TTGCTGCCCATC AAGCACGGCTTGTGTGTTGGGT CGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAG GCA GCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTAT GGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCC GGCCGGC GCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGA CCTCGGATCAGGTAGGG ATACCCGCTGAACTTAAG CATATCAATAAG GGAGGAAA

4.4.2 jcQ-93菌株扩增ITS部分基因序列

CTACCTGATCCGAGGTCACCTGGAAAAAGGATGAT TTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGG CCTACAGAGC GGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACG CGGTGCCGCCGCTGC CTTTGGGGCCCGTCCCCCCC GGAGAGGGGACGACGACCCAACACACAAGCCGTGC TTGAT GGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCC CCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGT TCAAA GACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACACTA GTTATCGCATTTCGCTGCG TTCTTCATCGATGCCGG AACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATT GCGATA AATCAACTCAACTTCACTAGAATCAGACA GAGTTCGTGGTGTCTCCGGCG GCGCGGGCCCGGGG CTGAGAGCCCCCGGCGGCCATGAATGGCGGGCCCG CCGAAGCAACTAAGGTACAG TAAACACGGGTGGG AGGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAAT GATCCTTCCGC AGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTA CG

采用真菌通用R/F引物扩增米曲霉ITS部分序列。经PCR扩增测序进一步鉴定其中ddQ-125和jcQ-93菌株确属于Aspergillus oryzae；将测得的A、B菌株的ITS序列在Gen-Bank数据库中进行同源序列比对。结果显示，两菌株与米曲霉的ITS序列相似性达到99%以上。

5 结论

从郫县豆瓣中分离筛选出得到两株优势菌，根据形态学和分子生物学的特性，鉴定为米曲霉，本研究采用真菌核糖体转录间隔区（ITS）的引物，进行PCR扩增，并将PCR产物进行ITS序列测序。测序结果与Genbank进行同源序列比对，结果显示菌株ddQ-125和jcQ-93的序列与Genballk已知序列相似率可达99%以上。霉菌的序列分析结果与形态学鉴定基本一致。新分离的高酶活菌株将用于郫县豆瓣复合菌制曲的研究。

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