血管性痴呆大鼠模型的改良

窦金金，谢宁，吴颂，史瑞，张真

(1.黑龙江中医药大学研究生学院，哈尔滨150040;2.天津中医药大学第二附属医院急症部)

改良2-血管阻断法(2-VO)+硝普钠降压是血管性痴呆(VD)研究中常用的模型之一［1］。此法制作模型可重复性、稳定性较好，其优点为手术操作简单，对动物创伤较小，易于恢复，尤其是以学习记忆能力低下为主要特点，与临床“血管性痴呆”的发病过程相似，存活率较高。适用于研究血管性痴呆的病理生理机制和评价药物的作用。传统方法分离双侧颈总动脉，腹腔注射硝普钠造成低血压，夹闭双侧颈总动脉10 min，再通10 min，如此反复2次，撤线，缝合伤口。本文拟对传统方法进行改良，探讨延长双侧颈动脉夹闭时间并增加夹闭次数建立VD模型的成功率。

1 材料和方法

1.1 模型的复制 将购买的雄性Wistar大鼠(由本校实验动物室提供)20只，体质量220～250 g，适应性饲养2周后，随机分为脑缺血模型组、假手术对照组，每组10只。各组大鼠手术前后均常规饲养。将大鼠用10%乌拉坦(1 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧颈总动脉(CCA)，模型组在夹闭双侧CCA之前，腹腔注射硝普钠(北京双鹤制药厂，2.5 mg/kg，用无菌蒸馏水溶解)，随即用无创动脉夹夹闭双侧CCA，20 min 后，再通 10 min，再夹闭 20 min，再通10 min，再夹闭20 min再通后缝合伤口，术后于颈动脉伤口处均匀撒入青霉素钠盐。假手术组麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断CCA及注射硝普钠。在全部造模过程中保持动物直肠温度在37℃左右，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用。

1.2 行为学测定 术后观察大鼠一般情况及成活率，于术后28 d使用Morris水迷宫对大鼠进行学习记忆能力的测定［2］。

定位航行试验:在水池里注入清水，使水面高出平台1～2 cm，水温控制在(24±2)℃左右，水池等分为4个象限(从右上、左上、左下、右下分别是一至四象限)。将平台放在第四象限中间，在其他三个象限任选一点面向水池池壁将鼠放入水中，试验历时4 d，每天上午每个象限各测试1次，每次测试1 min。若大鼠在1 min之内尚未找到平台，则将鼠拿到平台上并使它在上面站10 s，则其潜伏期为1 min;若鼠在1 min之内找到平台，也让其在平台上站10 s，方结束一次训练，如此训练4 d。记录大鼠分别在三个象限找到平台所需时间(即潜伏期)，计算平均值。

空间探索试验:在行为学测试第5天下午，定位航行试验结束后，撤除平台，然后从原始平台对侧象限入水点将大鼠放入水中，测其1 min内经过原始平台位置的次数以及平台象限游程占总游程的百分比。

1.3 形态学观察 行为学测试完成后，断头处死动物，取脑组织固定，取视交叉后4 mm处至小脑前的脑组织，然后做Nissl染色，光镜观察海马细胞形态变化。

1.4 统计学处理 采用SPSS10.0软件，数据分析运用t检验。

2 结果

2.1 基本情况 1周内体质量明显减轻，活动减少，饮食差，毛发蓬松且易脱落。手术28 d后，模型组存活9只，存活率与正常组差异无统计学意义。

2.2 行为学指标 在Morris水迷宫实验中，模型组路径比正常组明显延长，潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少、平台象限游程占总游程的百分比也显著降低，见表1，2。

表1 两组大鼠水迷宫定位航行实验结果(±s，m)

表1 两组大鼠水迷宫定位航行实验结果(±s，m)

注:与对照组比较，aP＜0.01

组别 鼠数(只) 第1天 第2天 第3天 第4天对照组 10 25.39 ±5.92 21.52 ±7.04 17.08 ±3.97 10.72 ±4.80模型组 9 48.59 ±6.27a45.92 ±8.01a41.12 ±5.80a35.65 ±4.37a

表2 两组大鼠水迷宫空间探索实验结果(±s)

表2 两组大鼠水迷宫空间探索实验结果(±s)

注:与对照组比较，aP＜0.01

组别 鼠数(只) 穿越平台次数平台象限游程占总游程的百分比(%)对照组10 6.62 ±2.23 39.47 ±8.07模型组 9 3.50 ±1.61a 26.45 ±4.31a

2.3 病理学变化 光镜下观察:对照组海马CA1区锥体细胞排列紧密有序，细胞核圆而大，边界及核仁清晰，胞浆内尼氏体丰富，而且均匀分布，神经纤维排列整齐;模型组海马CA1区锥体细胞大小排列紊乱、稀疏，细胞间隙增大，胞浆内尼氏体减少或消失，有数量不等的小空泡，呈均匀淡蓝色，细胞核变小，结构不清，核仁消失，神经纤维排列紊乱，神经元脱失现象明显。

3 讨论

VD是由一系列脑血管因素导致脑组织损害引起的痴呆综合征。患者表现为记忆及认知等功能障碍综合征，不仅严重损害患者的健康，影响患者的生命质量，也给家庭和社会带来沉重的负担［3-4］。在我国11个城市流行病学调查结果发现，60岁以上人群中VD的患病率为324/10万人口，老年性痴呆(AD)为238/10万人口，VD占各类痴呆的第1位。VD患者的平均生存时间为41个月，5年内死亡率达60%以上［5］。并且随着人类社会的老龄化，VD已是国内外医学界研究的重要课题，由于对本病的发病机制尚不十分明确，亦缺少治疗本病的特效药物，因此建立理想的VD动物模型对于探明VD的病因、病理过程以及寻找和筛选防治药物具有重要意义。

我们通过实验发现只要硝普钠注射量准确、可靠，操作者手法熟练同时环境温度恒定，适当延长双侧颈总动脉夹闭的时间并且增加夹闭次数没有严重影响大鼠的成活率，并且在术后通过对Morris水迷宫检测，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长，在规定时间内穿越平台的次数明显减少，空间记忆障碍明显，成功建造了大鼠痴呆模型。形态学观察可见明显的CA1区锥体细胞的变性、死亡、甚至丢失，这一变化印证了行为学的结果。而且动物没有明显的运动系统损伤表现，存活率较高。

［1］ 王蕊，杨秦飞，唐一鹏，等.大鼠拟血管性痴呆模型的改进［J］.中国病理生理杂志，2000，16(10):914-916.

［2］ Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nature Protocols，2006，1(2):848.

［3］ 俞德彩，张艳艳，刘巧玲.血管性痴呆与颈动脉粥样硬化的相关性研究［J］.中国临床保健杂志，2005，8(2):118-119.

［4］ 何静，谢道俊.血管性痴呆的中医药治疗［J］.中国临床保健杂志，2009，12(1):94-96.

［5］ Bomebroke M，Breteler NM.Epidemiology of non-AD dementias［J］.Clin Neurosic Res，2004，3(6):349-361.