抗C3a多克隆抗体对实验性结肠炎小鼠的疗效初探

陈 宇 魏克民 郑纯威 黄 强 李端杨 吴人照

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)，是一种慢性肠道炎症，多是由于遗传易感人群对肠道菌群的异常炎性免疫反应所引发［1］。此病在西方发达国家是一种常见病和多发病。在我国，发病率虽低于西方，但呈明显上升趋势，已成为严重影响人民健康的消化道疾病之一，对其发病机制和治疗方法的探讨一直是免疫学研究的重点和难点。三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)诱导的小鼠结肠炎病理特征与人类炎症性肠病(尤其是CD)极为相似，是研究IBD的发病机制，评价治疗方案的绝佳动物模型［2］。其主要发病机制为Th1型细胞因子分泌异常造成结肠黏膜损伤［3］。

近年来，有研究表明，补体系统参与了许多炎性和免疫性疾病的发生和发展［4］。但关于炎症性肠病是否存在补体系统的异常活化以及补体异常活化与炎症性肠病的关联性，研究甚少，本文对此问题进行了初步的实验研究。

材料与方法

1.动物:BALB/c小鼠，雄性，SPF级，体重18～22g，中科院上海实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(沪)2007－0005。日本大耳白兔，雌性，体重2.0～2.5kg，购自浙江省实验动物中心，生产许可证号为SCXK(浙)2006－0025。实验场地为浙江省中医药研究院，实验动物使用许可证号为SYXK (浙)2009－0122。

2.试剂:TNBS为Sigma产品，货号:P2297。C3a、TNF－α ELISA检测试剂盒购自BD Bioscience公司。MPO检测试剂盒和蛋白酶抑制剂购自Roche Diagnostics公司。ACD抗凝剂购自美国Baxter公司。

3.抗C3a抗体的制备:C3a多肽序列为IPMRYSCQRRARLITQGENC，将其与噬孔血蓝蛋白(KLH)连接(由杭州中肽公司合成)，免疫日本大耳白兔。每次免疫抗原用量为1mg，采用北部多点皮下注射免疫方式，首次免疫(抗原与完全弗氏佐剂质量比为1∶1)后3周加强免疫，以后隔2周免疫(加强免疫时，抗原与不完全弗氏佐剂质量比为1∶1)1次，第3次免疫后14天取血，ELISA检测血清抗体效价，并检测抗体对C3a刺激外周血白细胞高表达CD11b生物学效应的影响，评价其中和活性。所获得的多抗兔血清经硫酸铵饱和沉淀法粗提和蛋白A亲和层析柱纯化获得IgG。

4.分组、造模和给药:BALB/c小鼠随机分为对照组(n= 10)，模型组(n=15)，抗C3a抗体预防组(n=15)，抗C3a抗体治疗组(n=15)，泼尼松龙治疗组(n=15)。小鼠禁食12h后，腹腔注射速眠新+氯胺酮(速眠新和氯胺酮按1∶1混匀，50微升/只)，待小鼠麻醉后，用带9号针头的直径约0.5cm的硅胶管从肛门插入1cm，注入50μl TNBS溶液，对照组注入50μl 50%乙醇，然后将导管继续插入肠内至4cm，将100μl上述溶液注入肠内，总注入体积为150μl，TNBS剂量为2.5毫克/只。倒置小鼠1min，使药液达全结肠。对照组和模型组腹腔注射兔IgG，抗体预防组腹腔注射抗C3a抗体，时间间隔为－2，0，2，5天各注射1次，剂量分别为10、50、100微克/(次·只)。抗体治疗组的注射剂量为50微克/(次·只)，但时间间隔为2、5天各注射1次。泼尼松龙治疗组的腹腔注射剂量为1mg/kg，时间间隔与抗体治疗组相同。每天称量体重，观察腹泻和血便性状。

5.结肠病理:分离小鼠结肠组织，甲醛固定，常规包埋、切片，苏木素和伊红染色，镜下观察。

6.结肠蛋白上清的提取:分离小鼠结肠组织，剪取其中部分(约1.5cm)，称重，将蛋白酶抑制剂与结肠组胺1m l/100mg组织比例混合，用组织匀浆器充分匀浆，将匀浆液转入1.5ml离心管中，11000g，4℃，离心15min，收集上清，冻于 －40℃待测。

7.酶联免疫吸附实验:小鼠静脉采血后，ACD抗凝，2000r/min离心10min，收集上清，－40℃保存。实验操作严格按照ELISA试剂盒说明进行。

8.统计学方法:采用SPSS统计软件，数据以均数±标准差±s)表示，多组间两两比较采用Oneway－ANOVA统计分析方法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.TNBS肠炎模型建立早期出现明显的补体活化:补体系统被激活后，形成C3转化酶，将C3裂解成为C3a和C3b。C3a水平的升高反映了补体活化。因此，我们通过检测C3a水平以验证肠炎建立初期是否存在补体活化。如图1所示，TNBS肠炎建立后2h，与对照组相比，血浆和结肠蛋白上清中C3a含量显著升高。24h时，血浆中的C3a降至对照组水平，但结肠组织中的C3a水平仍明显高于对照组。上述结果提示，TNBS肠炎建立早期存在明显的补体活化，补体活化可能是诱发肠炎的早期事件之一。

图1 TNBS肠炎模型建立后不同时间点血浆和结肠组织中补体C3a表达水平检测

2.抗C3a抗体治疗有效缓解TNBS肠炎引起的体重下降:为评价补体C3a在TNBS肠炎中的病理作用，我们制备了抗C3a的多克隆抗体，通过建模前和建模后分别给药，观察抗体的治疗效果。如图2所示，与给予兔IgG模型组相比，抗体预防组小鼠体重下降得到明显遏制，且疗效呈一定的剂量依赖性，且小鼠腹泻症状明显减轻，血便性状显著缓解。更为有意义的是，当TNBS肠炎小鼠腹腔注射抗C3a抗体50微克/(次·只)后，小鼠体重降低的症状亦得到显著缓解，腹泻和血便症状明显减轻，疗效与泼尼松龙相当。这表明，抗C3a抗体治疗可能具有潜在的临床应用价值。

3.抗C3a抗体治疗有效减轻TNBS肠炎对肠道的破坏:观察期结束后，分离小鼠结肠组织，进一步观察抗体治疗后肠炎的病理变化。如图3所示，模型组小鼠结肠绒毛破坏严重，腺体减少，可见大量炎性细胞浸润，而抗体治疗组小鼠肠道破坏程度明显减轻，与泼尼松龙治疗组相当。人克罗恩病极为相似，是研究克罗恩病病理机制的理想模型。目前的许多研究主要着重于探究克罗恩病发展后期导致病理性改变的各种因素，并已取得重要的研究进展。但对于诱发克罗恩病的早期事件研究较少，本研究重点探究了补体活化与实验性肠炎产生之间的关联性。

我们的实验结果证实了补体活化是TNBS肠炎建立时的早期事件，并借助抗C3a抗体治疗证实了补体活化可能是一个重要的促炎因素。鉴于补体C3a是一公认的趋化因子，TNBS肠炎建立时，机体可通过多种途径激活补体系统(如经典、旁路、凝集素途径)，产生大量的C3a，从而募集粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等前炎性细胞等至病灶部位，分泌包括TNF－α在内的多种炎性因子，破坏肠道组织，导致肠炎发生。上述结果在一定程度上支持这一假设。

此外，我们的实验结果表明，抗C3a抗体可能具有潜在临床应用价值。目前，抗C3a的单克隆抗体正在加紧研制中。有意思的是，有文献报道，抗C5a抗体可有效缓解体重下降的症状，减轻肠道的破坏，此结论与抗C3a抗体治疗一致［8］。但由于补体C5a只在补体活化初期高表达，过表达的C5a可与细胞膜表面的C5a受体相结合，引起受体内化，从而导致体液中C5a含量降低，而C3a的内化效应并不明显。因此，有理由推测，相比于C5a，中和C3a可能具有更好的应用前景。

4.抗C3a抗体治疗下调TNF－α和MPO的表达:TNF－α是IBD的关键致病因子［5～7］。MPO表达水平反映了结肠病灶组织内中性粒细胞的浸润程度。我们在建模后4天，分离小鼠结肠组织，提取蛋白上清，检测TNF－α和MPO的含量。如图4所示，TNBS肠炎诱导后，结肠内TNF－α和MPO的含量明显升高。抗C3a抗体治疗能有效降低这两个因子的表达水平，这可能是抗C3a抗体治疗的机制之一。

图4 抗C3a抗体治疗下调TNF－α和M PO的表达

讨论

TNBS诱导的实验性肠炎病理特征和发病过程与

1 Sartor RB.Current concepts of etiology and pathogenesis of ulcerative colitis and Crohn's disease［J］.Gastroenterol Clin North Am，1995，24:475－507

2 TamboliCP，Doman DB，Patel A.Currentand future role ofbiomarkers in crohn's disease risk assessment and treatment［J］.Clin Exp Gastroenterol，2011，4:127－140

3 te Velde AA，Verstege MI，Hommes DW.Critical appraisal of the current practice inmurine TNBS－induced colitis［J］.Inflamm Bowel Dis，2006，12(10):995－999

4 Neurath MF，Fuss IJ，Kelsall BL，et al.Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice［J］.J Exp Med，1995，182:1281－1290

5 Guo RF，Ward PA.Role of C5a in inflammatory responses［J］.Annu Rev Immunol，2005，23:821－852

6 Rutella S，Fiorino G，Vetrano S，etal.Infliximab therapy inhibits inflammation－induced angiogenesis in the mucosa of patients with crohn's disease［J］.Am JGastroenterol，2011，106(4):762－770

7 Triantafillidis JK，Merikas E，Georgopoulos F.Current and emerging drugs for the treatment of inflammatory bowel disease［J］.Drug Des Devel Ther，2011，5:185－210

8 Mika D，Guruvayoorappan C.Myeloperoxidase:the yin and yang in tumor progression［J］.JExp Ther Oncol，2011，9(2):93－100