乳腺癌组织血清NF－κB p65表达分析及临床意义

杨明峰 李志国 孙红岗 董学君

NF－κB作为调节多种蛋白转录的转录因子，在乳腺癌的发生和发展过程中起十分重要的作用［1，2］。目前有不少的国内外文献报道NF－κB p65 mRNA在癌组织中高表达，且与癌症转移相关［3，4］;但NF－κB p65血清蛋白表达是否与组织mRNA表达一致，血清表达与病理特征有何关系，结果尚不一致。本文用ELISA法、RT－PCR法和Western blotting法检测乳腺癌患者血清NF－κB p65、组织NF－κB p65 mRNA及NF－κB p65蛋白的表达，分析组织和血清中的表达是否一致，血清学检测与临床病理特征有何关系，评价血清NF－κB p65在乳腺癌诊断和治疗中的应用价值。

材料与方法

1.材料:收集笔者医院2009年6～9月41例乳腺癌手术组织(病理诊断明确，术前未做过放疗和化疗)，癌旁组织和15例乳腺良性肿块组织为对照组(经HE染色观察图1)。收集上述乳腺癌患者血清，另收集39例乳腺癌患者血清，60例乳腺良性肿块和正常人血清为对照组。收集的组织和血清标本经分装后分别保存于液氮和－80℃冰箱。80例患者均为女性，年龄31～77岁，病理类型见表2。NF－κB p65 ELISA试剂盒(美国RD公司)，Trizol总RNA提取液(上海闪晶分子生物技术研究所)，Takara primeScriptTMRT－PCR Kit(大连宝生物工程有限公司)，PARISTM Kit(美国AMBION公司)，兔抗人NF－κB p65多抗(MILLIPORE公司)、兔抗人β－actin多抗(SANTA CRUZ公司)HRP－羊抗兔的IgG(SANTA CRUZ公司)，Bradford检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

2.免疫组织化学方法及阳性结果判定:石蜡标本4μm厚连续切片，脱蜡，采用高温、高压修复抗原，组化染色按SP试剂盒说明书进行。用PBS液代替一抗作为空白对照。ER、PR、Her－2均以细胞核和(或)胞质出现棕黄色细颗粒为阳性细胞，阳性细胞＜15%为－，15%～25%为+，25%～45%为++，＞45%为+++。背景无颜色或淡黄色。

3.组织NF－κB p65 mRNA的RT－PCR检测:乳腺癌、癌旁、乳腺良性肿瘤组织中总RNA的提取参照Trizol使用说明书。总RNA 1μg反转录为cDNA，反应条件:30℃10min，42℃30min，95℃ 5min。PCR扩增NF－κB p65/β－actin mRNA，引物由上海生工生物工程(上海)有限公司合成，序列如下:①NF－κB p65:上游引物5'－TGCCGAGTGAACCGAAAC－3'，下游引物5'－TGCCCAGAAGGAAACACC－3'，目的片段长度为527bp;②β－actin:上游引物5'－TTCCTTCTTGGGTATGGAAT－3'，下游引物5'－GAGCAATGATCTTGATCTTC－3'，目的片段长度为200bp。扩增条件:95℃3min预变性，94℃30s，60℃30s，72℃1min，35个循环;72℃ 7min延伸。阳性对照为乳腺癌细胞株MCF－7，用蒸馏水作为阴性对照。取5μl PCR扩增产物与1μl6×Loading buffer液混合均匀后进行1%的琼脂糖凝胶(溴化乙锭10mg/ml)电泳，计算机扫描成像判断结果。结果判断:样本琼脂糖电泳照片采用Quantity one分析软件进行灰度扫描，测定待测样本和内参β－actin的积分光密度(IA)。样本量的数值以目的片段IA/β－actin的IA的比值来表示。以乳腺癌(良性肿瘤)病灶组织的积分光密度比值/对应灶旁正常组织的积分光密度比值＞1.5为阳性，＞1.5以“+”表示，＞2以“++”表示。

4.组织NF－κB p65蛋白Western blotting检测:乳腺癌、癌旁、乳腺良性肿瘤组织中蛋白质样品的制备参照PARISTM Kit使用说明书。采用Bradford法检测蛋白提取液的浓度。蛋白提取液与上样缓冲液按3∶1混匀，100℃变性5min，上样至12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5h;湿转法将蛋白转移至PVDF膜上;用含2%BSA的PBST封闭1.5h;用含兔抗人NF－κB p65多抗(1∶500)、兔抗人β－actin多抗(1∶500)一抗孵育液4℃过夜，PBST漂洗，HRP－羊抗兔的IgG(1∶300)室温孵育2h，PBST、PBS漂洗后用ECL发光试剂在暗室压片显色。结果判断:胶片经扫描后，采用Quantity one分析软件进行灰度扫描，具体方法类同于RT－PCR检测的积分光密度比值＞1.5为阳性(+)。

5.血清NF－κB p65的ELISA检测:操作方法见试剂盒说明。浓度＞40ng/ml为阳性，＞40ng/m l为(+);＞80ng/ml为(++)。

6.统计学方法:采用SPSS 11.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差±s)表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验，Kappa一致性检验及Spearman秩相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.组织HE染色结果:显微镜下观察发现，41例癌组织标本癌细胞均占70%以上，而癌旁组织中无癌细胞浸润(图1)。

图1 乳腺癌及癌旁组织HE染色(HE，×200)

2.乳腺癌组织NF－κB p65的表达结果:41例乳腺癌组织中NF－κB p65 mRNA和蛋白积光密度比值＞1.5的分别为87.9%和82.9% 。乳腺癌组织NF－κB p65 mRNA的RT－PCR产物电泳结果表明乳腺癌组织NF－κB p65 mRNA的表达较对应癌旁组织及乳腺良性肿块组织明显增加(图2)。组织Western blotting结果与RT－PCR结果相似，乳腺癌组织NF－κB p65蛋白表达较对应癌旁组织及乳腺良性肿块组织明显增加(图3)。

3.血清NF－κB p65的表达及其与组织NF－κB p65表达的关系:乳腺癌患者血清中NF－κB p65的含量(46.4±26.13ng/ml)明显高于对照组(22± 16.5ng/ml)，两者差异有统计学意义(P＜0.05)。血清NF－κB p65与组织NF－κB p65表达同为“+”的23例，同为“++”的4例，同为“－”的3例。采用Kappa一致性检验，Kappa=0.458，95%可信区间(0.319，0.630)，可以认为具有一致性。采用相关(P＜0.05)，Spearman秩相关分析，rs=0.369，P＜0.05，表达一致率为73.2%(表1)。

表1 血清与组织中NF－κB p65表达的相关性

4.血清NF－κB p65与患者临床病理特征之间的关系:80例乳腺癌患者血清NF－κB p65阳性率为80%，对照组为13.3%(表2)。不同年龄段、TNM分期和ER、PR表达情况的血清NF－κB p65表达差异均无统计学意义。而不同淋巴结转移程度及Her－2表达状况的血清NF－κB p65表达差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2 血清NF－κB p65表达与乳腺癌临床病理指标的关系

讨论

NF－κB是具有多种生物活性的转录因子，正常细胞中NF－κB主要存在于胞质，与IκB结合，形成无活性的三聚体。当细胞受刺激时，NF－κB主要通过p65亚基在细胞核中调控多种基因的表达，在肿瘤形成和转移过程中发挥重要作用［5］。本研究结果表明，与对照组比(含良性肿块)，NF－κB p65 mRNA和蛋白在乳腺癌组织中表达均明显升高，与文献报道的一致［6，7］。由于大部分肿瘤相关抗原可分泌入血液，血清学检测简单快速，且血清标本可在未手术时取得，减小对患者的创伤性。本研究检测了血清NF－κB p65浓度，发现乳腺癌患者NF－κB p65表达明显高于对照组，而且Kappa一致性检验结果表明乳腺癌患者NF－κB p65血清表达与组织表达具有一致性，提示检测血清NF－κB p65浓度可部分反应组织NF－κB的活性，对诊断恶性乳腺癌具有一定的价值。我们采用HE染色法对收集的标本进行选择，癌组织中癌细胞率在70%以上，而癌旁组织则无癌细胞浸润，降低了实验取材误差，然而我们还是发现癌旁组织NF－κB p65有一定程度的表达;同时Kappa系数一般要＞0.7时，才表明吻合度好，所以血清检测不能完全取代组织NF－κB p65检测，这与癌旁炎症细胞表达NF－κB p65是否有关，需进一步研究。

目前多数国内外的研究表明，乳腺癌组织NF－κB p65的表达与乳腺癌的转移及Her－2高表达相关，本研究结果进一步表明乳腺癌患者血清NF－κB p65的表达与乳腺癌的转移及Her－2高表达相关，而这两个临床病理特征代表着乳腺癌的恶性程度，因此血清NF－κB p65检测可能是评判乳腺癌预后的指标之一。文献报道癌细胞NF－κB的表达与雌激素受体表达之间不一致，Jones等［6］认为NF－κB p65与ER、PR表达负相关，而Frasor等认为ER阳性时能增加NF－κB的活性，我们的研究表明血清NF－κB p65的表达与雌激素受体表达的相关性尚无统计学意义，因此我们认为血清NF－κB p65尚不能作为雌激素受体表达情况的预判指标。

总之，乳腺癌患者血清NF－κB p65浓度与对照组相比明显升高，且血清浓度能部分反应组织NF－κB p65的表达。同时血清学指标与临床病理特征关系的分析表明，血清NF－κB p65表达检测对预测乳腺癌转移与否和选择治疗方案也有一定的价值。

1 Vonach C，Viola K，Giessrigl B，et al.NF－κB mediates the 12(S)－HETE－induced endothelial to mesenchymal transition of lymphendothelial cells during the intravasation of breast carcinoma cells［J］.Br JCancer，2011，105(2):263－271

2 Liu M，Sakamaki T，Casimiro MC，et al.The canonical NF－kappaB pathway governsmammary tumorigenesis in transgenic mice and tumor stem cell expansion［J］.Cancer Res，2010，70(24):10464－10473

3 Bhaumik D，Scott GK，Schokrpur S，et al.Expression ofmicroRNA－146 suppresses NF－κB activity with reduction ofmetastatic potential in breast cancer cellsSuppression of NF－κB activity in cancer cells by miR－146［J］.Oncogene，2008，27(42):5643－5647

4 童仕伦，李恒平，魏文.胃癌组织中核转录因子－κB表达与意义［J］.中华实验外科杂志，2006，7(23):873－874

5 周洁，陈虎，郑海，等.Celecoxib可通过抑制核转录因子－κB活性诱导SGC7901/ADR细胞的凋亡［J］.中华实验外科杂志，2010，9(27):1269－1271

6 Jones RL，Rojo F，A'Hern R，et al.Nuclear NF－κB/p65 expression and response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer［J］.JClin Pathol，2011，64(2):130－135