儿科多重耐药铜绿假单胞菌外排泵基因表达及其危险因素分析

史桂梅 钟红平 刘世平

铜绿假单胞菌(psedom onas aeruginas，Pa)是目前难治性医院感染的主要致病菌，主要原因是Pa多重耐药(multidrug－resistance，MDR)株不断出现［1］。耐药结节细胞分化家族(resistance nodulation cell division family，RND)是细菌外排泵系统之一，在Pa的多重耐药中起着重要作用［2，3］。本文探讨多药耐药Pa的9种外排泵系统表达的分布趋势及其感染危险因素，为临床防治铜绿假单胞菌多重耐药的产生提供理论支持。

材料与方法

1.菌株来源:收集2008年1月～2010年12月笔者医院儿科多重耐药Pa感染病例97例。年龄为出生后7天～12岁，平均年龄7.8岁，其中痰标本37例，血标本29例，创面标本18例，导管标本8例，其他标本5例，菌株均经VITEK－Am s60全自动细菌鉴定系统和常规生化检测鉴定。

2.主要仪器试剂:荧光定量PCR仪、电泳仪、核酸蛋白分析仪、低温高速离心机、凝胶成像分析系统。TRIzol RNA提取液，Prime Script RT reagent Kit Perfect Real time试剂盒及Premix Taq Version 2.0，ABI7500荧光定量专用96孔板，琼脂糖，异丙醇，三氯甲烷，无水乙醇等分析纯。

3.实验方法:(1)细菌处理:收集临床标本培养的多重耐药Pa株，先用LB培养基摇菌增菌，后加入无菌甘油(20%终浓度)，－80℃冰箱保存待用。(2)基因检测:1)引物设计:参考文献进行PCR引物设计，所有PCR产物(＞150bp)进行双向测序，所测各基因序列与Pubmed数据库中相关基因进行Blast比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)［4～8］。2)细菌总RNA提取、cDNA的合成及反转录反应:LB培养基摇菌增菌，后加入无菌甘油，－80℃冰箱保存待用。提取总RNA之前置于冰上复温，然后接种于LB培养基中，240r/min，37℃振摇16～18h，取菌液3ml，4000r/min，离心3min，弃上清，加1m l TRIzol RNA提取试剂盒，按说明步骤提细菌总RNA，然后行凝胶电泳测RNA完整性，选择3条带清晰，A260/ A280=1.8～2.0的细菌总RNA行反转录反应，按试剂盒说明操作。3)PCR分析目的基因的表达:Pa菌株总cDNA进行PCR反应，每株菌均设rpsL为内参，反应产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V 5min，然后凝胶电泳成像仪拍照保存。4)realtime－PCR半定量分析目的基因的表达:反应体系:SYBR Premix Ex TaqTMII(2×)10.0μl，荧光定量PCR上下游引物(10μmol/L)各1μl，ROX Reference Dye or DyeII(50×)0.4μl，RT反应液(cDNA溶液)1.0μl，灭菌双蒸水补至20μl体系，ABI7500分析。分析方法采用2－ΔΔCT法半定量分析各基因表达量，重复3次计算结果。

结果

1.多重耐药铜绿假单胞菌耐药情况:具体见表1。

表1 多重耐药Pa药敏结果［n(%)］

2.各外排基因的表达情况:MexAB－OprM均表达(97/97)，MexEF－Op rN表达阳性率51.5%(50/ 97)，MexCD－OprJ为36.1%(35/97)，MexVMOprM为11.3%(11/97)，其他少见外排泵系统表达均较低，详见图1。

图1 9种Pa外排泵基因表达阳性率其中3种外排泵基因高表达散点图

3.多重外排泵基因表达分析:同时表达2种外排泵的有23株，占23.7%，MexAB－OprM与MexEFOprN组合(15株)，MexCD－OprJ与MexEF－OprM组合(7株)，MexXY－OprM与MexMN－OprM(1株)组合为主，未见其他组合;同时表达3种外排泵的有7株，占7.2%，主要以MexAB－OprM+MexEFOprN+MexXY－OprM组合，未见其他组合。

4.外排泵基因表达或高表达的危险因素分析:具体见表2、表3。

表2 铜绿假单胞菌主要多重耐药外排泵表达的危险因素单因素分析［n(%)］

表3 铜绿假单胞菌3种常见多重耐药外排泵表达或高表达的危险因素多因素Logistic回归分析

讨论

铜绿假单胞菌隶属非发酵菌假单胞菌属，是一种重要的条件致病菌，也是引起院内感染的重要病原菌［9］。Pa耐药机制复杂，耐药结节细胞分化家族的主动外排泵系统在Pa多重耐药机制中起主导作用［10］。目前已经发现9种Pa的外排泵系统，不同外排泵的表达导致细菌耐药谱各异。因此，研究各种外排泵表达的分布，对临床抗感染治疗有重要指导作用。本研究发现，MexAB－OprM在所有多重耐药Pa菌株中均表达，其高表达也达到44.3%，其次是Mex-EF－OprN(51.5%)，MexCD－OprJ(36.1%)，MexVM－OprM(11.3%)，除MexJK－OprM未发现之外，其他外排泵表达均较低，此外还存在多种外排泵系统组合表达的情况。而临床分离的敏感菌株中，除Mex-AB－OprM均低水平表达外(资料未显示)，未见其他外排泵系统的表达，说明各种外排泵的表达与菌株对抗生素的耐药存在相关性，与国内报道一致［11］。由于存在不同外排泵系统的组合表达，导致耐药的复杂和广泛化，使得临床治疗药物选择受限。

Pa外排泵系统的表达，部分是由于抗生素诱导而产生的。Kolayli等研究发现碳青酶烯类抗生素亚胺培南可以诱导Pa表达MexAB－OprM增高，但丁兆勇等［12］研究发现亚胺培南、环丙沙星对Pa浮游菌及生物膜菌的MexAB－OprM无诱导作用，因此需进行更大样本的研究。本研究通过单因素危险分析发现，糖肽类抗生素的使用可能导致MexAB－OprM的表达增高，机制不明。而碳青酶烯类抗生素及大环内酯类抗生素是MexEF－OprN、MexCD－OprJ诱导表达的危险因素，考虑这些抗生素是其合适的底物，过度使用使得耐药突变株被筛选出来而成为优势菌株。因此，严格规范这些抗生素的使用，可能会减轻Pa MexAB－OprM高表达和 MexEF－OprN、MexCD－OprJ表达，从而减轻细菌耐药。

多重耐药Pa外排泵基因表达的危险因素分析，发现碳青酶烯类和糖肽类抗生素的使用是Pa MexAB－OprM外排泵诱导性高表达的危险因素，碳青酶烯类和大环内酯类抗生素的使用是Pa MexEF－OprN、MexCD－OprJ外排泵诱导性表达的危险因素，提示不合理的抗生素滥用可能是诱导多重耐药Pa外排泵基因表达的危险因素。在Pa外排泵基因表达的传播性危险因素分析中，侵入性操作如气管插管机械通气、深静脉置管和留置导尿管等、低WBC、贫血、慢性基础疾病、入住ICU病房是Pa MexAB－OprM、MexEFOprN、Mex CD－OprJ 3种外排泵传播性表达或高表达的共同危险因素，可能是因为侵入性操作，破坏了机体的自然免疫屏障，增加了细菌接触机会，从而增加了耐药菌株在不同个体之间的传播。ICU病房环境中存在多数耐药菌株［13］，加之患儿免疫力低下及实施各种侵入性操作，极易导致周围耐药菌株的定植并感染。多因素Logistic回归分析发现，碳青酶烯类抗生素的使用、侵入性操作(包括气管插管呼吸机辅助通气和深静脉置管、留置尿管)、入住ICU病房是Pa 3种常见外排泵表达或高表达共同的独立危险因素。

总之，多重耐药铜绿假单胞菌对临床常用抗生素耐药严重，其耐药部分是由于Pa多重耐药外排泵表达或高表达所致。严格规范碳青酶烯类抗生素，大环内酯类及糖肽类抗生素的使用、防止患儿出现各种导致免疫力低下的因素以及严格把握入住ICU病房的准入标准，减少不必要的侵入性操作对于防止Pa多药外排泵系统诱导或传播性表达的产生具有重要意义。

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