MTT法测定异搏定联合化疗药物对胶质瘤细胞U251化疗敏感性评估

何国龙 金许洪 尹 剑 马跃辉 秦福创 叶 欣

脑胶质瘤起源于神经外胚层，是颅内发病率最高、最难治愈的恶性肿瘤，约占所有颅内肿瘤的35% ～61%［1］。尽管有手术、化疗和γ刀、X刀等治疗方法，但预后依然不佳。从临床治疗效果看，术后辅助化疗在胶质瘤的综合治疗中的作用越来越受到重视。本实验通过MTT法检测不同时间和剂量的化疗药物对脑胶质瘤细胞U125存活度的变化，来探讨异搏定分别联合化疗药物(阿霉素、长春新碱、足叶乙甙)在不同作用时间点和不同剂量的作用下对胶质瘤化疗敏感性的影响，进一步明确化疗敏感性的差异。

材料与方法

1.主要材料、试剂与仪器:U251细胞株购于中国科学院细胞研究所，DMEM培养基购于美国Invitrogen公司，阿霉素、长春新碱、足叶乙苷、异搏定购于美国Sigma公司;主要仪器包括:上海精密科学仪器有限公司紫外分光光度仪MC－756，美国SHELDON公司二氧化碳恒温培养箱TC2323等。

2.组别设置:一共4个组，第1～3组为实验组和第4组为对照组，具体见表1。

3.细胞培养:将U251细胞置于pH 7.2～7.4的DEME培养基(含10%胎牛血清，青霉素100U/m l，链霉素100U/m l)中，待细胞状态良好后进行铺板(96well);铺板，调整细胞浓度为5×104/m l，每孔加100μl细胞悬液。在37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养。培养24h，上药，弃去原培养液，用培养基稀释药物，配制成不同浓度的药物培养液，每孔100μl上药;倒置显微镜下观察细胞呈贴壁生长，形态良好无退化，待其铺满瓶壁70%～80%时，以0.25%胰蛋白酶消化，隔夜换液。对照孔直接换培养基。分别在各时间点(6、12、24、36、48、72h)检测。

4.MTT法检测:取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，接种，CO2恒温培养箱中培养24h后吸出培养液，弃去上清液。设置对照组及异搏定联合化疗组(阿霉素、长春新碱、足叶乙甙)时设置不同时间组(6、12、24、36、48、72h)观察时效关系。孵育4h每孔加入10μl 5mg/ml的MTT液;37℃恒温下孵育4h;弃去培养液，每孔加入150μl DMSO，37℃振荡10min，使结晶充分溶解;待结晶充分溶解后置于酶标仪上，测量各孔的光密度值 D值:测量波长570nm，参考波长为630nm。计算不同药物浓度的细胞存活度:细胞存活度(%) =实验组OD平均值/对照组OD平均值×100%。检测异博定对细胞存活率的影响。分析比较加异博定前后，异搏定对细胞存活率的影响。

表1 不同剂量对化疗敏感性影响的组别设置

5.统计学方法:用SPSS13.0统计学软件进行数据处理，以百分数(%)来表示。组间存活率的比较用χ2检验。

结果

用MTT法检测异搏定联合化疗药物对胶质瘤细胞U251化疗敏感性。根据OD值计算细胞存活率，用细胞存活率及不同药物浓度的对数值制作图(表2)。

实验结果表明，在体外，长春新碱低浓度区域，加入异搏定后，细胞存活率也有下降，但不明显。随着化疗时间的增加，细胞存活度在各组中均有减少，但在长春新碱组减少的幅度最大，阿霉素组次之，而足叶乙苷组最少。异搏定联合阿霉素组的浓度在0.3～60.0μg/ml，细胞存活度减少的幅度明显大于其他浓度;异搏定联合长春新碱组、异搏定联合足叶乙甙组在0.5～200.0μg/ml这段浓度时，存活度明显减少，以长春新碱组减少最为明显。72h时间点，阿霉素组细胞存活率为35.72%，长春新碱组细胞存活率为16.37%，足叶乙苷组细胞存活率为61.72%，组间比较有统计学差异，P＜0.05(表3)。不同时间点，细胞存活率在各组中均有减少，但在长春新碱组减少的幅度最大，阿霉素组次之，而足叶乙甙组最少。

表2 各化疗组不同药物浓度时细胞存活率的比较

表3 各化疗组不同时间点细胞存活率的比较

讨论

体外化疗药物敏感试验方法颇多，常用的有集落形成分析法、集落形成效率法、放射核素标记前体物抑制试验，多细胞肿瘤球体形成试验及MTT法，而MTT法已应用于各种肿瘤细胞系所代表的化疗药物的药物敏感性的筛选。有报道体外MTT与患者自体内的敏感性具有高度相关性［2］。对于脑胶质瘤术后化疗敏感性差的原因，除了化疗药物的血脑屏障通透性和多重耐药基因的诱导表达所引起外，未能针对肿瘤类型及个体选择敏感性药物进行化疗也是一个重要原因［3］。因此，针对胶质瘤对不同化疗药物的敏感性，为每个患者制定个体化的化疗方案，避免无效化疗，减少不必要的不良反应，提高化疗效果十分必要［4］。

研究表明单一用药疗效差的原因是多方面的。联合用药时，尤其是异搏定联合化疗药物对肿瘤细胞的打击面增宽，可应付多种不同的肿瘤细胞，并且还减少了耐药性的发生率。更为重要的是，异搏定联合化疗药物的剂量强度超过单一用药。对化疗具有一定敏感性的肿瘤来说，有利于总疗效的提高。国内有研究发现脑胶质瘤细胞化疗敏感性与化疗浓度及时间存在一定的关系，并且联合化疗的效果比单独化疗好［5］。于朝春等［6］根据化疗药物敏感性对肿瘤患者进行个体化化疗，认为应用药敏试验指导化疗有助于改善患者的生存状态，降低复发率和病死率，提高生存率。张伟等［7］利用MTT法对69例人脑胶质瘤标本进行化疗药物敏感性测定，认为同一药物及同一个体的胶质瘤标本对不同药物的敏感性差异很大。我们通过异搏定分别联合化疗药物(阿霉素、长春新碱、足叶乙甙)在不同作用时间点和不同剂量的作用下对胶质瘤化疗敏感性的研究，结果发现，随着联合化疗药物剂量的增加，化疗时间的延长，72h时间点，DOX组细胞存活率为34.57%，VCR组细胞存活率为13.44%，VP－16组细胞存活率为62.71%，长春新碱组对胶质瘤细胞U251的存活率影响最明显。同时，有研究表明，没有一种药物能够抑制所有肿瘤细胞系的生长［8，9］。我们的试验也证实了这一点。DOX、VCR、VP－16等药物为临床抗胶质瘤化疗常用药，但只有VP－16具有较高的敏感率(约62.71%)，而其他两种药物的敏感性均较低。说明VP－16对胶质瘤细胞作用较好。

此外，本实验还发现化疗药物作用时间与化疗敏感性也存在着一定的联系，但其内在机制尚不明确，需要进一步实验加以证实。体外实验结果与临床疗效相关性的资料表明，化疗药物体外敏感、体内敏感有效的符合率为50%～70%［6］。而体外药物敏感性试验，作为临床病人临床试验的前期研究或敏感度的预测，并制定个性化化疗方案具有重要价值［10］。

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8 Rampling R，James A，Papanastassiou V.The present and future management ofmalignantbrain tumours:surgery，radiotherapy，chemotherapy［J］.JNeurol Neurosurg Psychiatry，2004，75 Suppl 2:1124－30

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10 Van den Bent MJ，Hegi ME，Stupp R.Recent developments in the use of chemotherapy in brain tumours［J］.Eur J Cancer，2006，42 (5):582－588