fgl2参与重症急性胰腺炎大鼠微血栓形成

叶晓华 陈坛辀 杜 勇 黄智铭 吴金明 吴建胜

重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，SAP)是腹部外科常见病之一，常可并发全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MOF)，病死率极高［1］。近年来学者研究认为急性胰腺炎的发生与胰腺微循环障碍有密切关系，它参与了向重症急性胰腺炎演进的复杂病理生理过程［2］。fgl2凝血酶原酶又称纤维介素，可直接活化凝血酶原成为凝血酶原酶，从而迅速启动凝血过程，并参与多种疾病的凝血局部反应［3～5］。本实验旨在牛璜胆酸钠诱导大鼠重症急性胰腺炎模型中，观察fgl2凝血酶原酶在SAP大鼠胰腺中的表达，探讨其在SAP胰腺微血管病变中的作用及机制，为研究微循环障碍在重症急性胰腺炎中的作用及导致胰腺功能障碍和组织损伤的病理机制提供新的思路。

材料与方法

1.实验材料:(1)动物:健康SD雄性大鼠，质量200～250g，由温州医学院实验动物中心提供。(2)主要试剂与仪器:牛磺胆酸钠购自Sigma公司;Trizol试剂购自Invitrogen公司;FirststrandcDNAsynthesiskit购自MBI公司;PCRmix试剂盒购自上海达为科生物公司;兔抗大鼠fgl2凝血酶原酶多克隆抗体购自北京博奥森公司;EnVision试剂购自Dako公司;实时荧光定量 PCR仪及7500SequenceDetectionSystem为ABI公司产品;显微镜为Olympus公司产品;全自动生化分析仪为Hitachi公司产品。

2.实验方法:(1)模型制备及分组:实验前禁食过夜，自由饮水。将48只大鼠随机分成两组:假手术组(SO)、重症急性胰腺炎(SAP)组，每组各24只。SAP组大鼠采用4%的牛磺胆酸钠1ml/kg胰胆管逆行穿刺匀速注射制模。SO组仅翻动

胰腺几次即关腹。术后1、4、8h分批处死大鼠(各时点8只)，留取下腔静脉血、胰腺标本待测。(2)血清淀粉酶检测:采用全自动生化分析仪检测。(3)胰腺组织病理形态学观察:胰腺组织常规脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色及Masson染色。镜下观察胰腺病理改变。随机观察100根管壁外径≤100μm的微血管，并计算阳性血管率。(4)实时定量(real－time) PCR检测胰腺组织中fgl2表达:采用Trizol法提取总RNA，取4μg总RNA反转录合成第一链cDNA，引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计。引物序列:fgl2上游引物:5'－CCTGGAGATTGTGGTTTCGT－3'，下游引物:5'－TACCATGCCTTTCTCCAAGG－3'，扩增片段长153bp;β－actin上游引物: 5'－TGTCACCAACTGGGACGATA－3'，下游引物:5'－GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA－3'，扩增片段长153bp。反应条件: 50℃2min;95℃5min，95℃ 15s，循环40次。反应完成后，根据反应曲线计算thresholdcycle(Ct值)并计算目的基因相对表达量，目的基因量 =2－△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因－Ct管家基因)实验组－(Ct目的基因－Ct管家基因)对照组。(5)免疫组化染色:使用Envison法进行fgl2免疫组化染色。按Envision试剂盒说明操作。兔抗大鼠fgl2凝血酶原酶多克隆抗体(1∶100)为一抗。EnVision试剂(HRP－R/M)37℃孵育30min，DAB显色，苏木精复染。盐酸乙醇分化，氨水反蓝，最后脱水、透明、封片，镜检。PBS代替一抗作为阴性对照。各切片在200倍光镜下随机选取10个视野采用Image－ProPlus6.0图像分析软件测定其平均吸光度值并进行半定量分析。

3.统计学方法:采用SPSS15.0软件包进行统计学分析。所有数据以均数±标准差(±s)表示，进行正态性检验和方差齐性分析，采用单因素方差分析进行组间、组内差异性检验。两连续变量关联强度使用Pearson相关系数(r)表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.血清淀粉酶检测结果:SAP组血清淀粉酶较SO组在各时间点均显著升高(各时点P＜0.01)。SO组各时点间比较，差异无统计学意义(P＞0.05，表1)。

表1 各组大鼠术后各时点血清淀粉酶值(U/L)

2.形态学观察结果:镜下，SO组1、4、8h各时点胰腺组织形态未见异常，胰腺小叶清晰;SAP组1h时胰腺间质水肿，伴少量炎细胞浸润;4h后胰腺间质水肿，出血，炎细胞浸润显著增加;8h时严重出血坏死，见大量中性粒细胞和单核细胞浸润(图1)。

图1 各组大鼠术后HE染色(×200)

Masson染色用于观察微血栓形成，光镜下显示为高亮红色区。Masson染色显示血栓于胰腺微血管内皮，说明是由纤维蛋白形成的原位血栓。Masson染色阳性血管率在SAP组中的各时点显著高于正常组(P＜0.01)且具有增加的趋势(P＜0.01，表2、图2)。

表2 各组大鼠术后各时点胰腺阳性血管率

图2 各组大鼠术后Masson染色(×200)

3.fgl2mRNA及蛋白质的表达:SAP组大鼠胰腺的fgl2mRNA和胰腺fgl2蛋白质表达相比SO组均明显升高，且随病程延长逐渐增多(表3)。免疫组化染色显示，fgl2主要表达在SAP组大鼠胰腺微血管内皮细胞(图3)。

表3 各组大鼠术后各时点胰腺fgl2mRNA和蛋白表达量

图3 各组大鼠术后各时点fgl2免疫组化染色(×200)

4.胰腺fgl2表达与阳性血管率相关性分析:将SAP组大鼠胰腺组织fgl2凝血酶原酶表达水平与每100根微血管中阳性血管率进行Pearson相关分析。结果显示SAP组大鼠胰腺内fgl2凝血酶原酶表达的平均吸光度值与阳性血管率存在显著相关(r= 0.878，P＜0.01)。

讨论

急性胰腺炎可引起一系列免疫反应，影响病程发展及预后。在此进程中，凝血系统的功能也随之发生重大变化，其中主要有胰腺的微循环功能障碍［2］。目前主要认为巨噬细胞、中性粒细胞和内皮细胞激活，引起促炎细胞因子和炎症介质过度释放是胰腺微循环障碍发生的主要机制［6］。微循环障碍时的低血容量可导致血液的高凝状态。本研究结果显示SAP大鼠胰腺内原位微血栓形成，提示SAP大鼠胰腺功能障碍及组织损伤与其微循环功能障碍密切相关。fgl2凝血酶原酶的促凝途径与经典的内外源凝血途径不同，它可直接激活凝血酶原转变为有活性的凝血酶而促进凝血，同时fgl2凝血酶原酶接受细胞因子调控，具有促凝血和炎症的双重作用，Levy将fgl2凝血酶原酶的促凝途径，称为“免疫凝血”［3，7，8］。有研究报道，fgl2凝血酶原酶高表达于小鼠MHV－3爆发性肝炎、自发性流产、器官移植排斥反应等疾病的生理病理过程中［9，10］。它可通过触发急性炎症细胞聚集，在局部组织高表达，启动局部凝血过程，导致纤维蛋白沉积、微血栓形成、微循环障碍，最终导致脏器形态学变化和功能障碍。

本研究结果显示SAP大鼠胰腺本研究结果显示SAP大鼠胰腺中fgl2mRNA相比SO组显著升高(P＜0.01)，且随病程延长而逐渐增加(P＜0.01)。推测在胰腺炎病程中，炎症因子协同刺激大鼠微血管内皮细胞中fgl2凝血酶原酶基因，首先在转录水平上表达增高，再进一步增加凝血酶原酶合成，然后通过激活凝血系统导致胰腺组织微血管内血栓形成，从而促使胰腺坏死发生。免疫组化结果显示SAP大鼠胰腺微血管内皮细胞中可见fgl2凝血酶原酶蛋白高表达，且表达水平与微血栓阳性血管率正相关(r=0.878，P＜0.01)。该结果提示fgl2凝血酶原酶可能通过介导胰腺内微血栓的形成而促进重症急性胰腺炎的发生与发展。

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