脑外伤大鼠周围血中Th1/Th2比例变化及机制探讨

屈晓东 荔志云 周 杰 王茂德

许多研究表明颅脑外伤(TBI)会导致机体免疫系统受损而使患者的发病率和病死率增加。颅脑外伤可引起免疫系统和大脑之间的平衡破坏，从而导致伤后免疫抑制和感染的发生。常见的感染如肺部感染、尿路感染和伤口感染，颅脑外伤本身作为一个独立的危险因素，通过特定的机制，使患者对感染的易感性显著增加。感染不仅使患者的预后不良，也增加了医疗成本和经济负担。所以减少脑外伤患者感染的发生，具有十分重要的意义。因此，探讨颅脑外伤后免疫功能损害的机制可以帮助我们预防和治疗感染并发症，并为我们寻找新的治疗靶点提供理论依据。

颅脑外伤后对人体的体液免疫和细胞免疫功能都有影响，而其对细胞免疫的功能影响更明显。大量的研究表明，在颅脑外伤后体内的CD4+数量降低。CD4+T细胞有两个主要亚群Th1(主要分泌IL－2和IFN－γ)和Th2(主要分泌IL－4和IL－5)，Th1和Th2的比例变化在许多疾病的不平衡发挥重要作用，如Th1/Th2降低与哮喘的发生有关，Th1/ Th2比例增加可导致流产的发生，而颅脑外伤后机体Th1/Th2比例如何变化尚未见有报道。那么颅脑外伤后机体的Th1/Th2细胞比例是否失衡?变化的相关机制是什么?这将是本文努力解决的问题。

材料与方法

1.脑外伤模型的建立:实验动物选用成年SD大鼠(220～250g)，雌雄各半，均从西安交通大学医学院动物实验中心购买。将动物编号后应用随机数字表，将脑外伤大鼠(TBI组)分为4个亚组，即致伤后1、3、5、10天，每组8只，每个时间点对照组大鼠6只。到相应时间点从心脏取血，取血后处死大鼠。大鼠脑损伤模型参照改进的Feeney氏自由落体硬膜外撞击法，各对照组仅做右顶叶颅骨开窗，不致伤，其余操作同脑外伤组。整个造模操作过程严格无菌操作。对照组大鼠共24只，实验组动物造模共42只，死亡2只，动物造模成功率95.2%。

2.仪器和检测方法:FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);试剂:免疫荧光单克隆抗体CD3/CD4/CD25+Foxp3(美国Biolegend公司);IL－4和IFN－γ抗体(eBioscience公司)。

3.大鼠周围血中IFN－γ和IL－4的测定:从大鼠心脏采血2.5ml，室温下血液自然凝固10～20min，然后2000r/min离心10min，仔细收集上清，取出血清在－20℃封存，待统一检测，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。IL－4和IFN－γ水平用ELISA法(eBioscience)测量。IFN－γ检测的最小浓度为31.3pg/m l(表1);IL－4检测的最小浓度为1.6pg/ml(表2)。

4.大鼠外周血中CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞的流式细胞术测定:从大鼠心脏取血2ml，EDTA抗凝。采血后随即往西安交通大学医学院中心实验室统一用流式细胞仪进行检测。各试管中加入抗凝全血100μl，分别加入APC anti－rat CD4/PE anti－rat25和同型对照各20μl双色标记单抗试剂，混匀后室温避光20min，加固定液1ml静置10min，2000r/min离心5min，弃上清，加打孔液1ml，2000r/min离心5min，弃上清，然后加Alexa Fluor488 anti－rat Foxp3 Flow Kit 5μl，混匀，放置20min，然后加1m l PBS液重悬细胞，上机检测分析。各指标的测定按试剂盒说明书操作。数据处理使用处理软件，由电脑自动处理得出结果(图1、表3)。

表1 IFN－γ的浓度变化(pg/m l)

表2 IL－4的浓度变化(pg/m l)

图1 流式细胞术测定CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞结果

表3 Treg细胞数量测定结果

结果

实验大鼠生理参数，体重，神经检查发现，对照组大鼠通常在麻醉后6h恢复意识，而脑外伤组大鼠伤后持续约12h昏迷，致伤24h后几乎恢复正常饮食行为。脑外伤组大鼠左侧肢体偏瘫，爬行拖地，尾巴偏向左侧。对照组和脑外伤组大鼠体重在造模前和造模后无显著差异。

由表1可看出，颅脑外伤组大鼠外周血中IFN－γ浓度与对照组相比有明显差异。IFN－γ浓度在伤后从第1天升高，第3天继续升高，但与对照组相比这种差异无统计学意义(P＞0.05)。伤后第5天IFN－γ浓度继续升高，并且颅脑外伤组与对照组有统计学意义(P＜0.05)，直至伤后第10天，这种差异仍显著存在。

由表2可看出，颅脑外伤组大鼠外周血中IL－4浓度与对照组相比有明显差异。IL－4浓度在伤后从第1天降低，第3天继续降低，但与对照组相比这种差异无统计学意义(P＞0.05)。伤后第5天IL－4浓度继续降低，并且颅脑外伤组与对照组有统计学意义(P＜0.05)，直至伤后第10天，这种差异仍显著存在。

由表3可看出，颅脑外伤组大鼠外周血中Treg细胞数量从伤后第1天开始与对照组比较明显下降，且有统计学差异(P＜0.05)，这种变化直至伤后第10天仍持续存在。而对颅脑外伤各亚组的Treg细胞数量进行分析发现，在各颅脑外伤亚组中Treg细胞数量无统计学差异。IFN－γ和IL－4之间的对比关系为，颅脑外伤后大鼠外周血中IFN－γ的浓度逐渐升高，而IL－4的浓度逐渐降低的变化趋势。对IFN－γ和IL－4进行相关性分析，结果为IFN－γ和IL－4的变化呈明显负相关(Pearson相关系数－0.443)。

讨论

本研究中最重要的发现是，颅脑外伤可引起大鼠外周血中IFN－γ的浓度升高，IL－4的浓度和Treg下降。IFN－γ在脑外伤后第5天明显升高(P＜0.05)，而IL－4从脑外伤后第5天明显下降(P＜0.05)，这种下降趋势持续到脑外伤后第10天仍然存在。Treg细胞从脑外伤后第1天开始下降(P＜0.05)，直至脑外伤后第10天仍未恢复正常。

一般认为辅助性CD4+T细胞分为两类Th1和Th2［1～3］。通过对Th2细胞通路的激活模式主要引起白细胞介素增加，如IL－4、IL－5、IL－6、IL－10、IL－13，肿瘤坏死因子－α(TNF－α)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF);而Th1细胞则主要分泌IL－1、IL－2、IL－12、干扰素－γ(IFN－γ)，肿瘤坏死因子－β(TNF－β)和血小板聚集因子(PAF)，所以Th1主要分泌大量的INF－γ，Th2则主要分泌IL－4［4，5］。因此INF－γ是Th1的标志因子，有强大的免疫调节作用，IFN－γ能够刺激巨噬细胞和提高细胞毒性T的活性，诱导一氧化氮的产生，增加MHC分子共刺激信号，刺激CD4+T细胞向Th1方向分化，而抑制CD4+T细胞向Th2方向分化［6］。在动物模型中和临床治疗中IFN－γ还有抗病毒作用［7］;IL－4是由Th2细胞分泌的一种重要的促炎因子，具有多种生物学效应，IL－4一直被认为是Th2分泌的代表因子［8～10］。因此我们通过测定大鼠外周血中 INF－γ和IL－4的浓度来代表Th1和Th2的量的多少。IL－4和INF－γ作用相互拮抗，从而保持了Th1细胞和Th2细胞之间的动态平衡，这种抗炎和促炎之间的失衡会导致很多疾病的发生，Th1/Th2的失衡取决于Th1/Th2细胞失衡通路的激活，这两种途径往往是相互排斥的，一个起保护作用，而另一个则促使疾病的发生［11，12］。IFN－γ的持续升高，IL－4的进行性下降表明颅脑外伤后大鼠外周血中Th1/Th2趋于Th1，而远离Th2，这可能就是导致颅脑外伤后免疫抑制的一个原因。有研究表明IFN－γ的水平与颅脑外伤的严重程度呈正相关，所以IFN－γ的水平可以预测颅脑外伤的严重程度。

那么是什么原因导致颅脑外伤后血中Th1/Th2比例改变呢?Liesz A等［13］研究发现主要免疫调节因子CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞(Treg)是主要的脑保护调节因子，在缺血性脑损伤炎症后针对多种炎症通路进行调节。在Treg细胞缺失的小鼠脑梗死模型中，TNF－α、INF－γ和IL－1b的表达明显升高［13］。Campbell等［14］都表明了Treg细胞通过Th细胞相关转录因子，以维持或恢复免疫反应过程中极化的Th1、Th2和Th17细胞，以恢复免疫平衡。因此我们检测了颅脑外伤后大鼠外周血中的CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量，研究结果发现颅脑外伤组中大鼠外周血中Treg细胞数量与对照组相比明显减少，并且与Th1/Th2的比例呈明显的负相关(相关系数－0.367且P＜0.05)。在一些研究中发现Treg数量减少或功能抑制可以导致一些自身免疫性疾病。因此，Treg细胞数量的减少可能是颅脑外伤后血中Th1/Th2比例失衡的原因。在本研究中我们没有观察到这些指标在颅脑外伤后多长时间才能够恢复到正常水平，并且没有将大鼠分为颅脑外伤轻、中、重组进行观察。但这些问题将在我们后续研究中进一步解决。

总之，我们发现颅脑外伤可以引起大鼠外周血中IFN－γ水平明显升高，IL－4表达下降，Th1/Th2失衡可能是导致颅脑外伤后机体容易发生感染的一个原因。而颅脑外伤后血中Treg细胞的减少可能是导致Th1/Th2比例失衡的一个原因。Allan，S.E.等声称Treg细胞是一个潜在的抗炎细胞，用Treg细胞来治疗自身免疫性疾病，抑制移植排斥反应，促进癌症和慢性感染的免疫反应等方面表现出了令人兴奋的结果。James等研究表明通过基因治疗增加IL－4的表达，用以预防和(或)治疗大鼠关节液模型的关节炎、滑膜炎、降低促炎因子水平、血管化和骨退行性变等炎性改变，这提示对人类类似的治疗可能也是有益的。因此提高颅脑外伤后机体血中的Treg细胞数量，或增加颅脑外伤后机体血中的IL－4水平，或减少颅脑外伤后机体血中的IFN－γ浓度可能能够改善颅脑外伤患者的免疫状况，预防和(或)治疗颅脑外伤后的感染。因此Treg细胞在脑外伤后可能有潜在应用价值，提高IL－4水平或降低IFN－γ水平可能成为未来治疗颅脑外伤的方法。然而在应用到临床上的之前，仍有很多工作要做，但如果成功，可能会改变目前治疗颅脑外伤的治疗现状。

重型颅脑损伤患者伤后存在明显的Th1/Th2平衡偏移，如果我们从整体水平调节神经－内分泌－免疫网络的平衡，如增加免疫促进类激素或减少免疫抑制类激素，用细胞因子调理及免疫营养调节治疗等，就可以改善患者损伤后的Th1/Th2免疫失衡，增强患者机体抵抗力，降低患者继发感染发生率，提高临床治愈率。

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