具有广谱抑菌活性乳酸菌的筛选及抑菌物质分析

马妙莲，赵 静，陈晓琳，张付海，朱 敏，张 明,*

(1.安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省环境监测中心站，安徽 合肥 230036)

具有广谱抑菌活性乳酸菌的筛选及抑菌物质分析

马妙莲1，赵 静1，陈晓琳1，张付海2，朱 敏2，张 明1,*

(1.安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036；2.安徽省环境监测中心站，安徽 合肥 230036)

采用双层平板法从食用小米中分离出一株对实验所测的革兰氏阳性菌、阴性菌和霉菌有明显抑制作用的菌株，通过生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性分析，确定该菌株为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。经气相色谱-质谱联用仪和高效液相色谱初步分析该菌株发酵上清液中含有乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸和亚油酸等多种抑菌成分。

乳酸菌；抑菌；有机酸

食品在生产、加工和储存过程中极易受各种微生物的污染，从而导致食品变色、变味、腐烂发霉，特别是霉菌产生的霉菌毒素，极易引起人畜急性和慢性中毒，若长期食用会出现致癌和致畸现象[1]。另外食源性致病细菌也会引发各种疾病的发生，严重危害人类健康。为了延长食品的货架期，添加防腐剂是一种方便、有效的食品防腐方法，但目前普遍使用的化学防腐剂存在着体内残留、有一定的毒性和特殊气味等问题，因此开发广谱、高效、低毒的天然生物型食品防腐剂成为食品工业中重要的研究领域之一。

乳酸菌是广泛应用于食品、医药和饲料等行业的一类重要工业微生物，研究表明乳酸菌可以产生有机酸、过氧化氢、双乙酰、酶和细菌素等抑菌物质，从而抑制食品腐败菌、食源性致病菌[2-5]以及霉菌的生长，乳酸菌还具有阻止霉菌毒素形成和清除的功能[6-9]。乳酸菌广泛分布于自然界，特别是动物、植物和发酵食品中，这些乳酸菌大多可以产生抑菌物质，这为研究开发安全的食品防腐剂提供了根本的保障。本研究拟从食用小米中筛选对革兰氏阳性菌、阴性菌和霉菌具有明显抑制作用的菌株，并对其进行鉴定和抑菌物质的初步分析，以为进一步研究开发生物防腐、防霉剂提供有价值的菌种资源。

1 材料与方法

1.1菌株与培养基

检测菌：本实验分离产酸菌，分离自山西应县农家食用小米。

指示菌：金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、鸡白痢沙门氏菌、黄曲霉、苹果炭疽病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌由安徽农业大学微生物实验室保藏。藤黄微球菌、英诺克李斯特菌、单核增生李斯特菌 由广东省微生物研究所保藏。

培养基[10-13]：MRS培养基、菌种鉴定培养基、PDA培养基和LB培养基。

1.2 试剂与仪器

甲醇(色谱级) 上海凌峰化学试剂有限公司；硫酸上海振企化学试剂有限公司；氯化钠、硫酸钠、UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SK2072即用型PCR扩增试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限公司；二氯甲烷 国药集团化学试剂有限公司。

GC-MS QP 2010 Plus气相色谱-质谱联用仪、LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；PCR扩增仪 珠海黑马医学仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 产酸菌的分离纯化及发酵浓缩液的制备

小米加入自来水富集培养半个月后，取富集液200μL涂布于含有溴甲酚紫的MRS培养基上，37℃培养，挑取能使培养基变黄的菌株，即为产酸菌，进一步采用划线法分离纯化。

将各分离出的产酸菌分别接种到新鲜的MRS液体培养基中，37℃静置培养36h，4℃、9000r/min离心15min，倒出上清液即为发酵上清液，将其旋转蒸发，浓缩10～15倍制成浓缩液，4℃冰箱保存。

1.3.2 产抑菌物质菌株的筛选

制备黄曲霉孢子悬液[8]，取孢子悬液100μL与7mL 50℃左右的PDA半固体培养基混合，立刻倒在含有2%琼脂的素琼脂培养基上[14]，凝固后放上牛津杯。取200μL浓缩液注入牛津杯，28℃培养约35h，观察是否出现抑菌圈。设相同处理的MRS培养基作为对照。

1.3.3 菌株的鉴定

通过生理生化特性[11-12]和16S rRNA 基因序列同源性分析鉴定菌株[15]。

同源性比较：将PCR扩增产物的序列在NCBI网站上用Blast软件搜索相似序列，经ClustalX序列比对后，用Mega4.1程序构建系统进化树，自展值(bootstrap)为1000。

1.3.4 发酵浓缩液对黄曲霉孢子萌发的影响

将100μL黄曲霉孢子悬液和1mL发酵浓缩液同时加到5mL液体PDA培养基中。28℃、130r/min振荡培养，显微镜观察孢子萌发状况。设未加浓缩液的液体PDA培养基作为对照。

1.3.5 抑菌作用的测定

抑菌谱测定中对霉菌的抑菌活性检测方法参见1.3.2节；对细菌抑菌活性的检测方法参见文献[18-19]。

1.3.6 产酸菌LPEM818所产抑菌物质性质的分析

1.3.6.1 高效液相色谱对发酵液中有机酸成分的分析

将1mL发酵上清液经0.22μm针筒式水膜过滤后，稀释10倍作为样品。采用岛津高效液相色谱仪对发酵液中有机酸成分进行分析。VA-ODS液相色谱C18柱 (250mm× 4.6mm，5μm)。以2.5mmol/L NH4H2PO4(含1%甲醇) 溶液(pH2.5)为流动相，流速为0.5mL/min，柱温30℃，Prominence SPD-M20A PDA检测器，检测波长为210nm；进样10μL进行检测。

1.3.6.2 气相色谱-质谱联用仪对发酵液中有机酸成分的分析

将5mL发酵上清液加到具有磨口塞的150mL锥形瓶中，再加入50mL10%硫酸甲醇溶液，密闭，60℃水浴恒温酯化2h[16]。用滤纸将酯化液过滤到分液漏斗中，用15mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液。萃取液用20mL饱和NaCl溶液洗涤3次[17]，再用无水硫酸钠脱水，滤出无水硫酸钠至澄清透明。萃取液置于细口瓶中，取1.0μL进行气相色谱-质谱分析。

色谱条件：DB-5石英毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)；升温程序：初始温度60℃，以8℃/min升至190℃，保持2min；每分钟2℃升至210℃时保持5min；载气(He)流速1.0mL/min，进样量1.0μL；不分流进样。

质谱条件：电子轰击(EI)离子源；电子能量70eV；传输线温度275℃；离子源温度250℃；质量扫描范围10～400u；发射电流100mA，检测电压1.1kV。

1.3.6.3 混合酸抑菌作用的验证

配制乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸和亚油酸的混合溶液，使其终浓度分别为10、50、100、200mmol/L，采用牛津杯法测定混合溶液对各指示菌的抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 产抑菌物质菌株的筛选及鉴定

图1 菌株LPEM818发酵上清浓缩液对黄曲霉的抑制作用Fig.1 Inhibition of Aspergillus flavus by concentrated cell-free fermentation supernatant of strain LPEM818

从小米中筛选到3株产酸菌，其中菌株LPEM818的发酵上清浓缩液对黄曲霉有较强的抑制作用，图1中孔2和孔4抑菌圈平均直径为17.0mm，而MRS培养基的浓缩液没有抑菌作用(图1孔1和孔3)。

为了明确该菌株的分类学地位，对其进行了形态学、生理生化特性以及16S rRNA基因序列同源性分析。

菌株LPEM818菌体呈短杆状，革兰氏阳性；在MRS培养基上菌落呈乳白色，凸起、光滑、边缘整齐。

生理生化实验结果表明：菌株LPEM818不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶为阴性。能发酵葡萄糖、乳糖、木糖、半乳糖、棉子糖、蔗糖、甘露醇、甘露糖、纤维糖、鼠李糖、肌醇、M.R、卵磷脂酶、脂酶实验均为阳性，V-P、吲哚、淀粉水解实验均为阴性，牛奶分解酸凝固。

与GeneBank中的菌株进行16S rRNA基因序列同源性分析，结果表明菌株LPEM818的16S rRNA基因序列与戊糖乳杆菌ML34有99%相似性(图2)。

图2 以部分16S rRNA序列为基础构建的菌株LPEM818的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of LPEM818 and related strains based on partial 16S rRNA sequences

依据《伯杰氏细菌分类手册》[11]、《常见细菌系统鉴定手册》[12]、16S rRNA基因序列的同源性分析，确定该菌株为戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)。

2.2 菌株LPEM818发酵上清浓缩液对黄曲霉孢子萌发的影响

图3 菌株LPEM818发酵上清浓缩液对黄曲霉孢子萌发的影响Fig.3 Effect of concentrated cell-free fermentation supernatant of strain LPEM818 on the germination of A.flavus spores

将100 μ L黄曲霉孢子悬液和1mL浓缩液同时加到5mL液体PDA培养基中，28℃培养10h后，在加有浓缩液的PDA液体培养基中，黄曲霉孢子呈圆形，未萌发(图 3A)，而在没有添加浓缩液的PDA液体培养基中有大量孢子萌发，形成短菌丝(图3B)。培养2d后，实验组中孢子仍未萌发，而对照组菌丝生长旺盛(图3C)，且有孢子浮于液体培养基表面。这一结果说明菌株LPEM818发酵液的浓缩液对黄曲霉孢子萌发有明显抑制作用。

2.3 抑菌谱

以革兰氏阳性菌、阴性菌和植物病原菌作为指示菌，采用双层平板法检测菌株LPEM818的抑菌谱，结果见表1。

表1 菌株LPEM818的抑菌谱Table1 Antimicrobial spectrum of strain LPEM818

从表1可以看出，菌株LPEM818除了对黄曲霉有一定的抑菌作用外，还对苹果炭疽病菌、番茄枯萎病菌、棉花枯萎病菌有很强的抑菌作用。同时，对测试的细菌也有较强的抑菌作用，其中对四联球菌和鸡白痢沙门氏菌的抑菌作用最强，抑菌圈直径分别为49.0mm和46.3mm。

2.4 菌株LPEM818所产抑菌物质的分析

采用高效液相色谱分析经处理的菌株LPEM818的发酵上清液，结果见图4。对照乳酸、乙酸标准溶液的色谱图可知峰1和峰2分别为乳酸和乙酸，同时还伴有其他有机酸的生成。

图4 菌株LPEM818发酵上清液的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of cell-free fermentation supernatant of strain LPEM818

进一步采用气相色谱-质谱联用仪分析发酵上清液中的有机酸，有机酸甲酯的总离子流色谱图见图5。根据标准谱库检索确认发酵液中含有琥珀酸、柠檬酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸和亚油酸6种有机酸。

图5 菌株LPEM818发酵上清液中有机酸分析的总离子流图Fig.5 Capillary gas chromatographic total ion current profile of organic acids in cell-free

将检测到的8种酸配制成终浓度为10、50、100、200mmol/L的混合溶液，抑菌实验表明，终浓度为50mmol/L的混合酸对实验所测细菌(表1)有抑制作用，对黄曲霉没有抑制作用。终浓度为100mmol/L的混合酸对黄曲霉有微弱抑制作用，终浓度为200mmol/L的混合酸对细菌抑菌圈直径达到30mm以上。以上实验表明各种混合酸对细菌和霉菌的生长都有一定的抑制作用。

有相关文献报道[20-21]，柠檬酸、棕榈酸、油酸、硬脂酸及亚油酸等有抑制细菌和真菌生长的作用，与本实验的结果一致，Lavermicocca等[6]发现植物乳杆菌21B发酵液具有抑制真菌生长的作用，气相色谱-质谱分析发现发酵液中含有棕榈酸。Walters等[22]的研究表明亚油酸能抑制Rhizoctonia solani、Pythium ultimum、Pyrenophora avenae 和Crinipellis perniciosa等真菌的生长。Liu Siyun等[23]通过培养皿法观察到棕榈酸、油酸及亚油酸等有机酸对植物病原菌Alternaria solani、Colletotrichum lagenarium、Fusarium oχyspo rum f. sp. cucumerinum 和Fusarium oχysporum f. sp. lycopersici均有抑制作用。另外，除了抑制菌丝生长外，棕榈酸等多种脂肪酸还具有抑制孢子萌发的作用。

3 结 论

本实验从山西食用小米中分离出一株具有广谱抑菌活性的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)菌株LPEM818，其代谢产物对黄曲霉、革兰氏阳性菌、阴性菌具有较强的抑制作用。经气相色谱-质谱联用仪和高效液相色谱分析发现菌株LPEM818的发酵上清液中含有多种具有抑菌作用的有机酸，经验证可确定该菌产生的抑菌物质主要为各种有机酸的混合物。该菌株的发现为进一步研究开发生物防腐、防霉剂提供了有价值的菌种。菌株LPEM818的发酵上清液中未明确具体成分的峰，还有待进一步研究。

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Isolation of Lactic Acid Bacteria with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity and Analysis of Antimicrobial Substances

MA Miao-lian1，ZHAO Jing1，CHEN Xiao-lin1，ZHANG Fu-hai2，ZHU Min2，ZHANG Ming1,*
(1. School of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. Anhui Environmental Monitoring Center, Hefei 230036, China)

A strain with strong inhibitory activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and mold, named as LPEM818, was isolated from Millet by the overlay plate method. The strain was identified as Lactobacillus pentosus by physiological and biochemical characterization and 16S rRNA sequence homology analysis. In the cell-free fermentation supernatant, some antimircrobial substances including lactic acid, acetic acid, succinic acid, citric acid, palmitic acid, oleic acid, stearic acid and linoleic acid were found by GC-MS and HPLC analyses.

lactic acid bacteria；antibacteria；organic acid

Q935

A

1002-6630(2012)01-0162-04

2011-01-28

国家“863”计划项目(2008AA10Z319)；安徽省高校“十一五”优秀人才计划项目([教秘人]2004-100)

马妙莲(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为作物生物技术。E-mail：mml1986go@163.com

*通信作者：张明(1962—)，女，教授，博士，研究方向为微生物学。E-mail：zhangming@ahau.edu.cn