极大螺旋藻的硒富集化培养研究

杨莹莹，管 斌,*，孔 青，游 泳，高艳艳，张睿钦，李 肖，左 涛，刘进昌，侯庆云

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2. 烟台欣和企业食品有限公司研发中心，山东 烟台 264006)

极大螺旋藻的硒富集化培养研究

杨莹莹1，管 斌1,*，孔 青1，游 泳1，高艳艳1，张睿钦1，李 肖1，左 涛1，刘进昌2，侯庆云2

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003；2. 烟台欣和企业食品有限公司研发中心，山东 烟台 264006)

为得到大量含有机硒的极大螺旋藻(Spirulina maχima)，以生物量和藻体内硒富集量作为指标，研究不同硒添加量和硒添加方式对极大螺旋藻生长及富硒效果的影响。结果表明，分8d等量(100μL)多次添加100μg/mL Na2SeO3溶液，是最佳添加量和添加方式，可得到生物量为0.903g/L，单位干藻粉有机硒含量为1413.168μg/g的富硒极大螺旋藻。

极大螺旋藻；硒添加量；硒添加方式；生物量；有机硒含量

硒(selenium，Se)是人体必需的微量元素，构成若干抗氧化酶的活性中心，可影响机体抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，具有重要的生理功能和广泛的药理作用[1]。而螺旋藻(Spirulina)中含有极为丰富的营养成分和多种生物活性物质，硒与螺旋藻结合产生富硒螺旋藻。富硒螺旋藻在医药和营养保健品开发方面已显示出了应用价值[2-4]。在培养液中添加亚硒酸钠可以实现螺旋藻对硒的富集和有机化，而且螺旋藻对无机硒有较强的耐受性，工业化生产技术比较成熟，是对硒进行生物有机化的理想载体[5-6]。本实验通过无机硒不同添加量和添加方式，研究其对极大螺旋藻生长以及对硒生物富集效果的影响，以期获得大量的富含有机硒的极大螺旋藻，为后期提取更多含硒藻胆蛋白等创造条件。

1 材料与方法

1.1 藻种与试剂

极大螺旋藻(Spirulina maχima)为中国海洋大学生物工艺实验室保存藻种。

硒储备液：1号储备液：含10mg/mL Se(Ⅳ)的Na2SeO3溶液；2号储备液：含100mg/mL Se(Ⅳ)的Na2SeO3溶液。亚硒酸钠、碳酸氢钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-VIS 2802PC型紫外-可见分光光度计 尤尼柯)上海)仪器有限公司；722N型可见分光光度计 上海精密实验设备有限公司；QHX-250BS-Ⅲ人工气候箱 上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3培养条件与方法

在250mL三角瓶中加入100mL 优化Zarrouk培养基[7]，用培养6d的螺旋藻(OD560nm约为0.6)作为藻种，接种量10%，在温度30℃，初始pH值为9.3，光照度3500lx，光照时间24h/d条件下通气培养，每天定时摇动3次。其中培养条件是根据前期所做的极大螺旋藻培养条件优化实验所得[7-8]。

1.4 硒的添加方法

1.4.1 不同添加量

为使极大螺旋藻能适应含硒环境，需接种后在无硒环境中生长1d，积累一定的生物量后，自第2天起，连续8d在每天的同一时间，于培养瓶中加入2号硒储备液，采用等量添加方式，使硒总加入量分别达200、400、600、800、1000、1200、1400、1600μg/mL。每个浓度设2个平行，以不添加硒的螺旋藻作空白对照，培养至10d后收集藻体。培养方法同1.3节，每隔1d，测量560nm处的OD值，绘制生长曲线。收集的藻体用于测定生物量和藻内硒含量。具体添加方法如表1。

表1 等量添加方式下8d内每天加硒量Table1 Selenium addition at the equal daily amounts for 8 consecutive days

1.4.2 不同添加方式

在总加硒量为800μg/mL基础上，设计5种硒添加方式，每种添加方式设两个平行。同1.4.1节，各种方式均需在无硒环境中生长至少1d，即最早第2天开始添加硒。第9天所有方式均添加完毕，继续培养1d，待硒转化吸收。共培养1 0 d，收集藻体。培养方法同1.3节，每隔1d，测定波长560nm处的OD值，绘制生长曲线。收集的藻体用于测定生物量和藻内硒含量。添加方式如表2所示。

表2 硒添加方式Table2 Selenium addition modes

1.5 极大螺旋藻藻体收集和生物量测定

采用离心法。极大螺旋藻培养至第10天，测定藻液体积。倒入质量恒定的离心管中，5000r/min离心15min，弃去上清液，藻丝体用蒸馏水洗涤，5000r/min离心15min，如法清洗3次。将获得的藻体置80℃真空干燥箱干燥至质量恒定，记录数据，经计算即可得生物量。所得干藻粉于4℃冰箱保存，待用。

1.6 硒含量的测定

采用催化硒光度法[9]测定极大螺旋藻中的硒含量。

1.6.1 硒含量标准曲线绘制

分别吸取含硒0.4μg/mL的亚硒酸标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于比色管中，加入0.02mol/L EDTA溶液0. 8mL、0.2mol/L HCl-KCl缓冲液4mL、0.6mol/L KClO3溶液4mL、0.03mol/L 1,8-二羟基萘-3,6-二磺酸4mL、0.03mol/L盐酸苯肼2mL，加水至25mL，摇匀，在沸水浴中加热20min，于冷水中冷却几分钟后，用紫外-可见分光光度计于520nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。

1.6.2 极大螺旋藻硒含量测定

1)测总硒：称取干藻粉0.02g于锥形瓶中，加入混合酸(浓硝酸、高氯酸体积比4:1)15～20mL，加热至发烟，待溶液变为淡黄色后，再加热2～3min，此时溶液变为无色，冷却后定容至100mL，待用。2)测无机硒：取0.02g干藻粉于100mL蒸馏水中，小火微沸30min，过滤得到滤液，定容至100mL，待用。

取适量所得样品液于比色管中，加入各种试剂，具体步骤同1.6.1节，测520nm处吸光度，通过对照硒含量标准曲线即可求得富硒螺旋藻中的总硒、无机硒含量。总硒含量减去无机硒含量得有机硒含量。定义有机硒比率为有机硒含量与总硒含量的比值，即：

2 结果与分析

2.1 硒添加量对极大螺旋藻生长的影响

当硒质量浓度低于400μg/mL时，能明显促进极大螺旋藻的生长，在生长前期(前5d)400μg/mL硒的促进作用大于200μg/mL，5d后200μg/mL硒更有利于极大螺旋藻的生长(图1)。当硒添加质量浓度为200μg/mL时，获得最大生物量0.678g/L(图2)。在较低的质量浓度条件下，硒在细胞内参与谷胱甘肽过氧化物酶的合成，它在超氧化物歧化酶的协助下，可有效地清除细胞内的活性氧自由基，延缓衰老，促进藻细胞的生长[10]。当添加量800、1000μg/mL硒时，前期促进了极大螺旋藻生长，而后期抑制作用明显(图1)。出现这种情况的原因为：因分多天等量加硒，前期时，培养液中硒含量较低，分别为其添加总量的1/2左右(即第5天时积累量分别为100、200、300、400、500、600、700、800μg/mL)，随着培养液中硒含量的不断增加，硒对极大螺旋藻的促进作用变弱，抑制作用变强。实际上，当培养液中硒含量≥300μg/mL时(即总添加量为600μg/mL的第5天)，已开始抑制极大螺旋藻的生长。同时也可以看出，分8d添加硒含量400μg/mL，最终生物量高于未添硒的对照组(图2)；而4d即添加400μg/mL硒(总添加量为800μg/mL的第5天)时已开始对极大螺旋藻产生强烈抑制作用(图1)，使生长速率迅速下降。

图1 不同硒质量浓度条件下极大螺旋藻的生长曲线Fig.1 Growth curve of S. maχima under the environment with various selenium concentrations

图2 硒添加量对螺旋藻生物量的影响Fig.2 Effect of selenium addition amount on the biomass of S. maχima

更高的硒质量浓度(≥1200μg/mL)将导致极大螺旋藻的生物量及生长速率明显下降，这可能与高硒对藻的毒性有关[11]。特别地，当硒质量浓度高达1400μg/mL以上时，将导致极大螺旋藻的过早死亡。

本实验中，多次等量添加硒，总硒添加量≤400μg/mL时，可促进极大螺旋藻生长，而在周志刚等[12]的研究中得出结论：超过60mg/L硒对其藻种产生抑制作用；400mg/L是其藻忍受的最大极限，即致死阈值。该实验是以一次性加硒作为实验基础的，故对螺旋藻的抑制作用明显。其次，虽然实验都采用极大螺旋藻，但各实验室的极大螺旋藻因长期培养、保藏的差异，其生理生化性能也会略有差异，故对硒的耐受性也会不同。从图1可以看出，总硒添加量为1600μg/mL，第2天开始一次性添加了200μg/mL硒，在第2～3天的生长期内，并没有对极大螺旋藻产生明显抑制作用。杨芳等[13]的研究，以一次性加硒为实验基础，当硒质量浓度高于1000mg/L时，(极大)螺旋藻的生长完全被抑制甚至死亡；当质量浓度大于320mg/L时对螺旋藻的生长产生明显抑制，同样验证不同极大螺旋藻对硒的耐受程度不同。

杨芳等[14]的另一项研究在极大螺旋藻生长的第5天开始一次性加硒400μg/mL，添加总量最高达1000μg/mL，但对极大螺旋藻的生长抑制作用不是很强，最终生物量仍达0.9g/L以上。余景[5]在极大螺旋藻生长过程中分7d添加硒质量浓度1000μg/mL，对其生长几乎无影响或有弱的影响，已将高质量浓度硒对螺旋藻生长的抑制作用大幅度降低。这些结果与本实验数据是有一致性的，同时说明通过对极大螺旋藻藻种和硒添加方式的改进，可以得到较高产量的富硒极大螺旋藻。

研究表明：分多次等量添加硒，硒添加量≤400μg/mL时，可促进极大螺旋藻生长，且前5d高质量浓度硒促进作用较好，后期低质量浓度硒促进作用加强；添加硒质量浓度为800～1000μg/mL时，前期促进生长，后期严重抑制生长，且质量浓度愈高，抑制作用愈明显。硒质量浓度≥1200μg/mL时，在藻生长期一直起抑制作用。

2.2 硒添加量对极大螺旋藻富硒效果的影响

表3 硒添加量对极大螺旋藻富硒的影响Table3 Effect of selenium addition amount on the enrichment of selenium in S. maχima

从表3可以看出，当加硒量为800μg/mL时，单位干藻粉有最高有机硒含量，达971.836μg/g，有机硒比率也达到最高97.44%。硒质量浓度＞800μg/mL时，随着培养基中硒质量浓度的增加，极大螺旋藻中的总硒含量和有机硒比率逐渐降低，说明极大螺旋藻对硒的富集和转化具有一定的限度，可能原因为硒的毒性引起藻体对硒的排斥[15]。硒添加量为200μg/mL时，生物量为0.678g/L，有机硒含量为178.711μg/g，培养液中含有机硒量为121.17μg/L；加硒量为800μg/mL时，生物量为0.447g/L，有机硒含量为971.8μg/g，培养液中含有机硒量为434.39μg/L，是前者的3.6倍。因此，添加800μg/mL的硒，虽抑制了极大螺旋藻的生长，但为得到较多的有机硒和质量好的富硒极大螺旋藻，仍选择此条件作为下一步实验的基础。

2.3 硒添加方式对极大螺旋藻生长的影响

图3 不同硒添加方式下极大螺旋藻的生长曲线Fig.3 Growth curve of S. maχima under the condition with different selenium addition modes

从图3可看出，在极大螺旋藻生长初期一次性添加硒(实验组1)会导致藻体死亡，这与郑文杰等[16]研究中所述一次性加硒质量浓度≥800mg/L时，极大螺旋藻会严重中毒死亡，结果一致。而在中间分3次添加(实验组2)，因一次硒添加量≥250μg/mL，会对螺旋藻产生强烈抑制，添加完后，第8天部分藻体已开始死亡。这与陈填烽等[17]的研究结果出现较大差异。原因主要是因为藻种的不同，钝顶螺旋藻一般比极大螺旋藻耐硒程度大[14]，在0.02～411.00mg/L质量浓度范围内硒对(钝顶)螺旋藻生长有促进作用[18]，有的在552μg/mL条件下仍能正常生长[19]。而极大螺旋藻的一次性添加耐受硒质量浓度低于400μg/mL[12]，故不适合短时间内大量加入硒。

图4 硒添加方式对极大螺旋藻生长量的影响Fig.4 Effect of selenium addition mode on the biomass of S. maχima

从图4可以看出，分多次添加比一次性添加和中间加硒有利于极大螺旋藻的生长，等梯度加硒(实验组4)得到最高生物量1.11g/L，结合等量加硒(实验组3)和前后段等量加硒(实验组5)分析，实验组4前期加硒量较少，在极大螺旋藻生长比较敏感的前期，对其抑制作用较小，从而生物量能较快积累。所有添加方式在添加800μg/mL的前提下，均未能消除对极大螺旋藻生长的抑制作用。

2.4 硒添加方式对富硒效果的影响

因实验组1严重抑制螺旋藻生长，故不考虑此种方式对极大螺旋藻富硒的影响。实验组2因添加时间较晚，富集硒量较少，且没有得到很好的转化。等量添加方式下极大螺旋藻达到最高有机硒含量，且有机硒转化率最高。可能原因为极大螺旋藻在早期已适应高含量的硒浓度，后期生长的藻的富硒能力较强。结合图4和表4可以看出，硒对极大螺旋藻生长和富集硒具有不同步性。虽然方式3条件下，极大螺旋藻的生物量不是很高，但与实验组4、5相差不多，但胞内有机硒含量有较大的优势，为得到优质的高富硒量的极大螺旋藻，仍然以等量添加作为最好的添加方式。

表4 硒添加方式对极大螺旋藻富硒效果的影响Table4 Effect of selenium addition mode on the enrichment of selenium in S. maχima

3 结 论

极大螺旋藻对硒具有极强的耐受能力和吸收转化能力，以等量多次添加的形式添加800μg/mL的硒，生物量略有下降，但仍能生长正常，并能获得较高的总硒及有机硒含量，有机硒转化率可达95%以上。确定此方法为收获高质量的富硒极大螺旋藻的最佳条件。该实验结果与许多文献[20-23]相比，富硒能力较强，除培养条件略有差别外，主要原因为藻种不同。其次，由于螺旋藻生长特性限制，实验重复性较差些，致使条件一致时，结果略有不同。可以看出，螺旋藻藻种不同，培养条件不同，会很大程度影响富硒螺旋藻的富硒量和生物量。本实验未能消除800μg/mL 硒添加量，等量添加方式下硒对极大螺旋藻的抑制作用，可进一步考虑从改良藻种和改变培养条件等方面，提高富硒极大螺旋藻的生物量，为研究富硒螺旋藻的高密度培养以及从中提取含硒活性物质打好基础。

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Cultivation of Selenium-Enriched Spirulina maχima

YANG Ying-ying1，GUAN Bin1,*，KONG Qing1，YOU Yong1，GAO Yan-yan1，ZHANG Rui-qin1，LI Xiao1，ZUO Tao1，LIU Jin-chang2，HOU Qing-yun2
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2. Research and Development Center, Yantai Shinho Food Co. Ltd., Yantai 264006, China)

In order to achieve selenium enrichment in Spirulina maχima, the effects of different amounts and strategies for selenium addition on the growth of S. maχima as indicated by biomass and selenium concentration were explored. The addition of 100μL of 100 μg/mL Na2SeO3 at the same time each day for 8 consecutive days after 1 day of growth in Se-free environment was found optimal, resulting in a biomass of 0.903g/L and an organic Se content of 1413.168 μg/g dry S . maχima.

Spirulina maχima；selenium addition amount；selenium addition mode；biomass；organic selenium content

TS201.1

A

1002-6630(2012)01-0106-05

2011-01-22

国家自然科学基金项目(31000823)；山东省自然科学基金项目(ZR2010CM050)

杨莹莹(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物工程。E-mail：yangyingying923@163.com

*通信作者：管斌(1957—)，男，教授，博士，研究方向为酶工程。E-mail：guanbin@ouc.edu.cn