乌梅提取物对蜡状芽孢杆菌的抑菌机理研究

刘梦茵，刘 芳，周 涛，诸永志，徐为民,*

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097)

乌梅提取物对蜡状芽孢杆菌的抑菌机理研究

刘梦茵1,2，刘 芳1，周 涛2，诸永志1，徐为民1,*

(1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097)

研究乌梅提取物抑制蜡状芽孢杆菌的抑菌机理。通过碱性磷酸酶含量的测定研究乌梅提取物对细胞壁完整性的影响；采用考马斯亮蓝法测胞外蛋白质量浓度的变化；通过观察电导率变化研究乌梅提取物对细胞膜通透性的影响；采用SDS-PAGE电泳法观察乌梅提取物作用下菌体蛋白质的变化。结果表明：乌梅提取物破坏细菌细胞壁和细胞膜的结构，导致细胞膜通透性增加，进而使细胞内容物外泄；同时乌梅提取物对细菌蛋白质的合成有一定影响，阻碍细菌蛋白质的正常表达。

乌梅；抑菌机理；蜡状芽孢杆菌

乌梅为蔷薇科植物梅(Prunus mume Sieb. et Zucc)的将成熟的果实青梅经干燥而成，是一资源极为丰富, 应用范围极广的传统中药[1]。蜡状芽孢杆菌是一种好氧性、可以形成芽孢的革兰氏阳性杆菌，分布广泛[2-3]。已有研究者证明乌梅提取物具有很强的抑菌作用[4]。经过前期实验，证实乌梅能够抑制蜡状芽孢杆菌的生长，本实验对乌梅提取物抑制蜡状芽孢杆菌的机理进行研究，为乌梅的开发和利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

碱性磷酸酶试剂盒 南京建成生物工程公司；N-(2-羟乙基)哌嗪-N, -2-乙烷磺酸(HEPES) 北京索莱宝科技有限公司。

UV-6100紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司；HH-8数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；TG16-WS台式高速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DDS-11A电导率仪 上海理达仪器厂。

1.2 菌种与培养基

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus) 江苏省农业科学院农产品加工研究所畜产品实验室。

牛肉膏蛋白胨培养基、营养肉汤 北京陆桥公司。

1.3 菌悬液的制备

取对数生长期的菌液，于5000r/min离心10min，取其沉淀用pH7.0的2.5mmol/L HEPES缓冲液洗涤一次，重悬浮在HEPES缓冲液中，制备成OD650nm值为0.800± 0.02的菌悬液备用。

1.4 乌梅提取液的制备工艺流程

1.5 乌梅提取物对细胞壁完整性的影响

这个夜晚，我捧着一碗米汤，像是捧着一碗全世界最烈的酒。我把这最烈的酒献给一棵樟，这个夜晚，我对着它说出了心底的秘密，希望能长出它一样的勇气。

分别将1倍和3倍最低抑菌质量浓度(MIC)的乌梅提取物加入到菌悬液中，于37℃、150r/min摇床培养，以蒸馏水代替提取物作为对照组，定时取样，3500r/min离心10min，取上清液用碱性磷酸酶试剂盒方法测定碱性磷酸酶(AKP)的含量，随时间延长检测AKP含量的变化情况。

1.6 乌梅提取物对细胞膜通透性的影响

分别将1倍MIC和3倍MIC的乌梅提取物加入到菌悬液中，于37℃、150r/min摇床培养，用蒸馏水代替提取物作为对照组，定时取样，测定菌悬液的电导率值。

1.7 乌梅提取物对胞外蛋白的影响

取1.5节方法制备的上清液用考马斯亮蓝法[6]测定胞外蛋白质质量浓度。

1.8 细菌蛋白质SDS-PAGE电泳分析

将培养至对数期的蜡状芽孢杆菌加到含1倍MIC浓度乌梅提取物的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，使培养基含菌体107个/mL，以加蒸馏水的菌液为对照，于37℃、150r/min摇床培养，并于3、 6h和9h分别取样6mL。各样品均稀释成相同的OD650nm值后离心取沉淀，在各样品沉淀中分别加入50μL无菌水和200μL上样缓冲液混匀，于100℃水浴中煮沸5min，再次离心取15μL上清液上样进行电泳。

2 结果与分析

图1 胞外碱性磷酸酶含量的变化Fig.1 Effect of Fructus Mume extract on extracellular AKP content

碱性磷酸酶是存在于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，正常情况下在胞外不能检测到其活性。但当细胞壁或细胞膜遭到破坏后，透性增加，其将泄漏到细胞外，通过检测细胞外酶的变化可以反映细胞壁的透性变化[7-8]。从图1可以看出，经乌梅提取物作用后胞外碱性磷酸酶含量明显增大，3倍MIC乌梅提取物处理的菌悬液碱性磷酸酶的含量高于1倍MIC乌梅提取物处理的样品，差异显著(P＜0.05)。实验结果表明乌梅提取物对蜡状芽孢杆菌的细胞壁有一定破坏作用，造成细胞壁通透性的增加，破坏了细胞结构的完整性，导致了胞外碱性磷酸酶的增加，高质量浓度的乌梅提取物对细胞壁的破坏力更强。

2.2 乌梅提取物对细胞膜通透性的影响

细胞膜是细菌的保护屏障，当细菌遇到强抑菌剂而使细胞膜遭到破坏时，菌体的保护屏障被打破, 使其内部电解质外泄至培养液中，进而使培养液的电导率上升，因此，菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化[9]。

图2 乌梅提取物对菌体处理不同时间的电导率变化Fig.2 Effect of Fructus Mume extract on electrical conductivity

由图2可知，0h时添加乌梅提取物的菌悬液的电导率值高于对照组，可能是由于乌梅提取物自身的带电荷成分使电导率值增大。随着时间的延长，添加乌梅提取物的菌悬液电导率逐渐增大，且添加3倍MIC乌梅提取物的菌悬液的电导率增大趋势更明显，而对照组电导率值基本不变。因此推断乌梅提取物破坏了细胞膜的完整性，使细胞膜通透性增加，细胞质渗漏，电解质不断渗出，导致电导率的升高。

2.3 乌梅提取物对胞外蛋白质量浓度的影响

图3 乌梅提取物对胞外蛋白质量浓度的影响Fig.3 Effect of Fructus Mume extract on extracellular protein content

由图3可知，乌梅提取物作用后的菌悬液胞外蛋白质质量浓度增大，3倍MIC的乌梅提取物处理的菌悬液胞外蛋白质含量高于1倍MIC乌梅提取物处理的样品。由于蛋白质分子相对较大，因此当细胞膜完整性受到破坏时蛋白质大分子会大量泄漏到胞外。乌梅提取物的加入使蜡状芽孢杆菌的细胞破裂，造成细胞质外泄，因细胞质中含有大量蛋白质成分，从而引起胞外蛋白含量的提高。

2.4 细菌蛋白质SDS-PAGE电泳分析

图4 乌梅提取物作用下蜡状芽孢杆菌蛋白质的SDS-PAGE电泳Fig.4 SDS-PAGE of culture supernatants of Bacillus cereus after incubation in the presence of Fructus Mume extract

由图4可知，随着时间的延长细菌在培养基中生长，蛋白质的谱带逐渐增多并变清晰。与对照相比添加乌梅提取物的菌体蛋白电泳谱带变浅或消失。3h时R2谱带与对照相比变浅；6h时R1、R3、R4消失，R2变浅；9h时各谱带均变浅。这说明乌梅提取物对菌体蛋白正常代谢有一定的抑制，使其蛋白总量表达水平呈下降趋势。

3 讨论与结论

本实验通过对碱性磷酸酶含量、电导率和胞外蛋白质量浓度的测定，发现乌梅提物物破坏了蜡状芽孢杆菌的细胞壁和细胞膜的完整性，导致内容物渗出。李小芳等[10]研究发现细胞膜是壳聚糖对金黄色葡萄球菌作用的位点，壳聚糖改变了细胞膜的渗透性而使细胞膜破坏，伴随大量细胞内容物泄露。张赟彬等[11]研究发现荷叶精油可造成大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌菌体细胞膜透性的变化，引起菌体内含物的渗漏，从而造成液体培养基电导率和还原糖含量增加。钱丽红[12]研究了茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理，结果表明茶多酚可破坏细胞膜的结构、导致细胞通透性增加，进而使细胞内容物外泄。韩诚武[13]研究发现副干酪乳杆菌影响了菌体细胞膜选择通透性，引起质子动力势的耗散，导致细胞死亡。张纬等[14]研究柠檬提取物对耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用，可能是通过破坏细菌细胞壁，改变细菌某些关键的结构或功能蛋白的合成来达到对细菌的抑制作用。另外，细菌蛋白质SDSPAGE电泳分析结果表明乌梅提取物抑制了菌体蛋白的正常代谢。韩淑琴等[15]、王关林等[16]分别在研究仙人掌提取物和发根土壤杆菌K84所产细菌素的抑菌机理时发现，SDS-PAGE电泳时，抑菌物质作用后的蛋白谱带中蛋白条带减少、颜色变淡，推断是由于抑菌物质阻碍了DNA对蛋白质合成的表达或是蛋白质正常合成过程受阻。钱丽红[12]通过SDS-PAGE分析，证实茶多酚可以阻碍细菌蛋白质的正常表达，以致影响其细胞的结构组成以及酶的催化活性，最终导致细菌正常生理功能的丧失。

本实验结果表明，乌梅提取物对蜡状芽孢杆菌具有抑制和破坏作用，作用机理是乌梅提取物破坏了细菌的细胞壁和细胞膜的完整性，增加了细胞膜的通透性，使细胞内容物渗出，使电导率增大，胞外蛋白含量增加，造成菌体不可恢复性损伤，从而失去代谢和增殖活性；同时乌梅提取物干扰了菌体蛋白的正常表达。

[1]阮毅铭. 乌梅的化学成分及药理作用概述[J]. 中国医药导刊, 2008, 10(5): 793-794.

[2]KRAMER J M, GILBERT R J. Bacillus cereus and other Bacillus species[M]// DOYLE M P. Food borne bacterial pathogens. New York: Marcel Dekker, Inc., 1989: 21-70.

[3]ANDERSSON, RONNER U, GRANUM P E. What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens[J]. International Journal of Food Microbiology, 1995, 28(2): 145-155.

[4]许腊英, 余鹏, 毛维伦, 等. 中药乌梅的研究进展[J]. 湖北中医学院学报, 2003, 5(1): 52-56.

[5]郑钧镛, 王光宝. 药品微生物学及检验技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1989.

[6]郭蔼光, 郭泽坤. 生物化学实验技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 2007.

[7]HARA S, YAMAKAWA M. A novel type of antibacterial peptide isolated from the silkworm, Bombyχ mori[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(50): 29923-29927.

[8]黄秀琴, 王卫星. 补体对大肠杆菌的致死过程[J]. 华东师范大学学报: 自然科学版, 1996(2): 103-105.

[9]马迪根M T, 马丁克J M. 微生物生物学[M]. 11版. 李明春, 杨文博,马迪根M T, 译. 北京: 科学出版社, 2009: 95-113.

[10]李小芳, 冯小强, 杨声, 等. 壳聚糖对金黄色葡萄球菌抑菌机理的研究[J]. 中国食品工业, 2010(9): 81-83.

[11]张赟彬, 缪存铅, 宋庆, 等. 荷叶精油对肉类食品中常见致病菌的抑菌机理[J]. 食品科学, 2010, 31(19): 63-66.

[12]钱丽红. 茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理[J]. 微生物学通报, 2010, 37(11): 1628-1633.

[13]韩诚武. 副干酪乳杆菌素抑菌活性及抑菌机理的研究[D]. 哈尔滨: 黑龙江大学, 2008.

[14]张纬, 孙晓明, 徐建设, 等. 柠檬提取物对耐药金黄色葡萄球菌抑制作用机制的初步研究[J]. 中国病原生物学杂志, 2009, 4(9): 652-655.

[15]韩淑琴, 杨洋, 黄涛, 等. 仙人掌提取物的抑菌机理[J]. 食品科技, 2007 (3): 130-134.

[16]王关林, 姜丹, 方宏筠, 等. 高产细菌素菌株WJ K84-1的诱变筛选及其对植物病原菌抑菌机理的研究[J]. 微生物学报, 2004, 44(1): 23-28.

Anti-Bacillus cereus Mechanisms of Fructus Mume Extract

LIU Meng-yin1,2，LIU Fang1，ZHOU Tao2，ZHU Yong-zhi1，XU Wei-min1,*
(1. Institute of Agricultural Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；2. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

The objective of the present study was to investigate the mechanisms for the inhibition of Bacillus cereus by Fructus Mume extract. The effect of Fructus Mume extract on the integrity of cell wall was studied by determining the content of alkaline phosphatase (AKP). The contents of extracellular proteins were assayed by Bradford method. Cell membrane permeability was examined based on changes in electrical conductivity. The effect of Fructus Mume extract on the synthesis of bacterial proteins was analyzed by SDS-PAGE. The results indicated that Fructus Mume extract could damage the structures of cell wall and cell membrane, causing an increase in cell membrane permeability and the release of intracellular contents. Fructus Mume extract could also affect the synthesis of bacterial proteins and block protein expression in bacteria.

Fructus Mume；nantibacterial mechanism；Bacillus cereus

TS202.3

A

1002-6630(2012)01-0103-03

2011-03-11

江苏省农业科技自主创新资金项目(CX(09)627；CX(10)230)；江苏省自然科学基金项目(BK2010469)

刘梦茵(1986—)，女，硕士研究生，研究方向为食品生物科技。E-mail：liumengyin19861201@163.com

*通信作者：徐为民(1969—)，男，研究员，博士，研究方向为食品加工与质量控制。E-mail：weiminxu2002@yahoo.com.cn