NO、CO和H2S与缺血性脑损伤关系研究进展

彭雪梅 综述，晏 勇 审校

(重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016)

20世纪80年代以后学者相继发现动物和人体内也存在一定浓度的一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)和硫化氢(H2S)等气体。这些气体分子可由生物体自身合成,均具有神经递质和调质作用，它们的生物作用有所不同,但可以单独或者联合的形式,在多个系统及其多种疾病的生理及病理过程中起调节作用。它们的产生及传感机制引起了学者的兴趣。中风已成为中老年人致残的主要原因并成为世界第3大死亡原因[1]。在缺血性中风的发生、发展过程中，发现NO 、CO和H2S均参与其中。本文就这3种气体信号分子在缺血性脑损伤中的作用及相互关系的研究进展作一综述。

1 NO与缺血性脑损伤

在鸟氨酸循环过程中,一氧化氮合酶(NO synthase，NOS)催化L-精氨酸胍基末端的氮原子与分子氧结合形成一种自由基气体，即内源性NO。NOS在中枢神经系统广泛存在，多位于大脑皮质、海马CA1和CA3区、杏仁核、纹状体。NOS活性因所在部位不同而明显不同，活性较高的NOS存在于大脑皮质灰质中,无活性或活性低下的NOS存在于白质中。目前，已知的NOS有3种亚型：内皮细胞型NOS(eNOS),它定位于血管内皮细胞，在血管舒张中起作用;诱导型NOS(iNOS),它定位于免疫细胞、神经胶质细胞，负责巨噬细胞的活化作用;神经元型NOS(nNOS),它定位于神经元，涉及神经元细胞信号传递。eNOS和nNOS称为结构型NOS(cNOS)，在病理条件下因钙通道开放钙离子内流,细胞内的钙离子增加被激活产生NO，最初NO具有神经保护作用,随着持续刺激产生大量的NO具有神经毒性作用。iNOS不依赖钙离子，在免疫激发和神经元损伤时，iNOS激活持续产生大量的NO发挥细胞毒性。

过去的研究表明在脑缺血性再灌注损伤中NO具有神经保护[2]及神经细胞毒性双重作用。在脑缺血的极早期阶段(小于2 h)，eNOS被激活产生NO和NOx，在10 min达到高峰期，在60 min逐渐恢复到基线水平。NO作为血管舒张因子对脑缺血神经元实施神经保护作用[3],其机制包括：(1)NO扩张脑血管改善微循环，减轻缺血半暗带的损伤[4]。(2)NO能够亚硝化氧化还原剂巯基,N-甲基-L-门冬氨酸(NMDA)受体毒性因二硫键形成，钙离子内流被抑制而减轻。(3)NO与活性氧基团反应，减轻了脑缺血时自由基对神经元的炎性反应[5]。随着脑缺血时间延长,由eNOS来源的NO的神经保护作用消失，而代之以nNOS及iNOS来源的NO发挥其神经毒性作用,包括：(1)NO与氧自由基迅速结合生成过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)，其降解物NO2-可造成细胞蛋白质、核酸及脂质膜的损伤。 (2)NO可损伤线粒体酶系统抑制能量合成[6]。(3)NO通过抑制核苷酸还原酶(即DNA合成限速酶)及碱基脱氨基作用抑制DNA的复制及损伤DNA,导致细胞凋亡[7]。(4)NO浓度升高可导致微循环衰竭,细胞组织炎症反应，加重脑损伤。

2 CO与缺血性脑损伤

哺乳动物内源性CO是血红素氧化酶(heme oxygenase，HO)降解血红素大量产生的一种气体，同时产生二价铁(Fe2+)和胆绿素。这反应是通过烟酰胺腺嘌呤(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， NADPH)和细胞色素P450还原酶 (cytochrome P450 reductase)供应电子给O2完成的。HO是血红素降解反应的起始酶和限速酶，在体内分布广泛。HO-l为诱导型，在应急状态下可表达激活起抗氧化作用，主要分布于脾脏、肝脏、骨髓和网状内皮细胞。HO-2为结构型，无诱导性，是生理状态下的主要存在形式，主要分布于脑和睾丸中。HO-3分布于脾脏、胸腺、前列腺、心脏、肾脏和睾丸，其活性很低，可能对血红素依赖的细胞结构蛋白具有调节作用。

HO/CO系统是神经血管调节器，研究表明缺氧缺血时脑内HO-1表达增强，降解血红素导致血浆CO水平显著增高。更多的证据表明CO是依赖BKCa通道活性激活，调节血管平滑肌扩张血管，增量调节脑血流量，降低血液的黏附性，对脑组织的缺血缺氧状态得到改善，从而起保护作用[8]。Imuta等[9]研究表明缺氧缺血4 h时脑内HO-1表达增强，血浆CO水平显著增高，在缺血12 h时达高峰。产生的CO能活化鸟苷酸，增加环磷酸鸟苷(cGMP)，舒张血管平滑肌。韩遵义和杨光田[10]建立大鼠全脑缺血再灌注模型，发现脑缺血再灌注1 h时HO-1的活性、CO及cGMP含量明显升高，但海马CA1区单位面积神经元存活数目并无明显减少，推测在病变早期HO-1的活性的升高、CO含量升高是对大脑的保护作用。但随着CO增加的高峰期到来，脑血管过度扩张,脑血流量灌注过度，可因循环障碍出现脑水肿加重缺血性脑损伤。

3 H2S与缺血性脑损伤

内源性H2S主要由胱硫醚合成酶(cystan thionine synthetase,CBS) 与胱硫醚裂解酶(cystanthionine lyase,CSE) 对含硫氨基酸如L-半胱氨酸(L-cysteine) 的酶解催化产生。CBS是产生内源性H2S的主要酶系，是惟一属于5′-磷酸吡哆醛依赖性酶的血红素蛋白。在人类它主要分布于大脑和肺部中，其在脑的海马组织中高度表达。脑内的CBS含有血红素结合区和S腺苷蛋氨酸(S-ademethionine,SAM) 调控点,其由约551个氨基酸残基组成。血红素结合区是CBS 的功能性亚基，它主要是负责CBS与其作用底物的结合以及改变和维持CBS的空间结构。SAM调控点能控制CBS的激活或抑制，它主要通过与SAM结合改变酶的立体构象来完成。CBS活性的调节还受Ca2+/钙调素的影响，当神经元受到刺激兴奋时,Ca2+内流增加,促使钙调素结合并激活CBS，从而增加H2S的生成。

证据显示KATP通道是硫化氢作用的核心靶点，KATP通道兴奋开放，是硫化氢作用于血管舒张平滑肌细胞的主要机制。Hu等发现格列本脲(KATP抑制剂)可以抑制H2S的舒张效应。电生理研究直接证明外源性H2S能增KATP电流，这种作用同样能被格列本脲抑制[11]。另外，研究发现NMDA受体可能是H2S的作用位点。近期研究发现生理浓度的硫化氢具有抗氧自由基的作用[12],能阻止神经元避免受兴奋性氨基酸(如谷氨酸)、过氧化亚硝基等导致的氧化应激。Kimura等发现H2S能显著减少氧化应激所致的细胞死亡。任彩丽等[13]研究结果显示，缺血再灌注12 h前脑皮质组织 H2S含量、CBS酶活性均明显升高，缺血再灌注24 h时又显著降低，缺血再灌注48 h恢复至正常。周银燕等[14]在实验中发现脑缺血再灌注后， CBS-mRNA表达和H2S生成量在大鼠海马组织中均增加；应用羟氨(CBS抑制剂)预处理，CBS-mRNA表达和H2S生成明显减少，进一步进行电镜观察神经细胞线粒体变形率增高,提示内源性H2S在缺血再灌注脑损害中对神经细胞可能有保护作用。还有研究表明，H2S能降低体温和代谢率，从而减轻缺血再灌注损伤[15-16]。此外，一定程度的 H2S增高，能够扩张血管，增加供血，起到代偿作用。但同时内源性H2S过高的表达，可增强N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体介导的钙超载而导致细胞损伤。

4 NO、CO和H2S在缺血性脑损伤中的相互作用

HO、NOS和CBS是分别产生CO、NO和H2S的酶,也是一种血红素蛋白。血红素蛋白分子是NO、CO和H2S气体分子产生、运输和传感的关键载体,并且是气体分子相互作用的重要场所。血红素蛋白第一个功能是气体运输,有代表意义的就是运输氧气(O2)的肌红蛋白和血红蛋白。这些含铁血红素蛋白质有广泛的配体,其中包括CO、NO及H2S。气体配体和血红素之间的结合是可逆的,在它们的结合和释放过程中气体配体之间进行了竞争。血红素蛋白第2个功能是转移电子,有代表性的就是线粒体的细胞色素C。这类蛋白传递单电子到真核细胞线粒体呼吸链的细胞膜化合物上。电子的传递发生在非朊基亚铁血红素蛋白含铁部分,使铁离子转换在2个氧化态:Fe2t和Fe3t。血红素蛋白的第3个功能是促进发生在特定酶的氧化还原反应催化部位的抗氧化反应。在这种情况下,血红素蛋白通过O2和电子氧化或H2O2在非朊基亚铁血红素还原反应来调解酶反应。加氧酶是可以催化O2作用于酶底物的一类酶,HO和NOS就属于这类酶。血红素蛋白的第4个功能是气体的传感器。与上述3种功能不同的是,只有位于气体传送蛋白功能性亚基中的血红素蛋白有此作用,血红素蛋白可以传递信号给蛋白的功能区,CBS和sGC属于这一类酶。尽管HO、NOS和CBS这些酶有自行的途径识别特定的载体和辅助因子,并避免因气体类似的极性和配体形状出现生理混乱,但气体信号分子间的交互作用确实存在。在脑缺血过程中，缺血后氧化应激可导致HO-1/CO、iNOS/NO和CBS/H2S系统的激活，CO、NO和H2S大量产生，三者均参与缺血性脑损伤的病理生理过程，它们相互促进或相互抑制，形成一个复杂的调控网络。

4.1HO-1/CO与iNOS/NO相互关 在缺血性脑损伤早期，HO-1活性增强作用于血红素产生CO，CO作用于血管平滑肌扩张血管，增量调节脑血流量，降低血液的黏附性，对脑组织的缺血缺氧状态得到改善。同时CO弥散入血与细胞胞浆中鸟苷酸环化酶(sGC)血红素基团上的Fe2+结合，形成CO-亚铁血红素配位复合体而激活，催化三磷酸鸟苷(GTP)生成环磷酸鸟苷(cGMP)；cGMP作为第二信使可促进Ca2+内流，激活Ca2+依赖性的eNOS ，产生NO，NO可激活可溶性GC，增加cGMP，舒张血管平滑肌。神经元损伤后,iNOS不依赖Ca2+自行激活持续产生大量的NO发挥神经细胞毒性作用,NO在中枢神经系统内激活鸟苷酸环化酶，引起cGMP合成的增加，cGMP激活细胞外信号调节激酶(ERK)1/2/P90RSK信号转导通路诱导神经元发生凋亡[17-18],是缺血性脑损伤中主要机制。另外，CO可竞争取代结合在血红蛋白上的NO，进一步释放出过量NO发挥神经细胞毒性作用。并在脑缺血晚期，因CO、NO的血管舒张作用,脑血管持续过度扩张，血液淤积血流缓慢，循环内的有效血流量减少，进一步加重缺血缺氧性脑损伤。因此，HO-1/CO与NOS/NO系统在脑缺血早期是保护作用，在脑缺血中晚期可能具有相互促进作用，加重了缺血后脑损伤。

4.2iNOS/NO与CBS/H2S相互关系 在缺血性脑损伤时,iNOS因神经元损伤被激活大量产生NO。一些亚铁血红素包括曾被认定为CO信号传感器细胞色素P450，这些酶中的亚铁血红素对CO和NO都敏感[19]。因此，作为类似于细胞色素P450的CBS酶可因NO与其血红素结合区结合激活,导致H2S生成增加；另一方面CBS酶可因缺血缺氧直接激活增量调节H2S的生成。有人曾提出H2S可抑制NOS的合成[20]。除气体信号分子调节酶的活性外，化学反应也被认为参与了调节机制。Whiteman等[21]在实验中体外培育供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)和NO可形成RSNO,由此推测H2S和NO之间可反应产生RSNO；相反地,发现H2S可以降低GSNO，进而释放NO。但H2S作为一种还原剂，其生成增加又可抑制NO产在还原性环境中。周银燕等[14]在实验中发现H2S和NO在脑缺血-再灌注后大鼠模型海马中表达增加，但应用CBS抑制剂后H2S表达减少而NO表达明显增加，证明缺血缺氧可激活iNOS和CBS产生大量的NO和H2S，NO可进一步激活CBS增加H2S生成量，H2S生成增加又可抑制NO产生。NOS/NO体系在早期是以eNOS/NO为主，则和CBS/H2S体系在脑缺血早期是保护作用；在中晚期以iNOS/NO为主则起损害作用，而CBS/H2S 体系对神经细胞起保护作用，两体系之间可能是损害与抗损害的关系。

4.3HO-1/CO和CBS/H2S相互关系 在缺血性脑损伤早期，缺血缺氧致HO-1和CBS活性增高，进一步产生CO与H2S。在活体内多项实验支持CBS是CO的传感器，CO可以抑制CBS 的活性，减少H2S的生成[22-23]。其机制可能是CO与CBS结合替换含硫的配体，抑制了硫化氢生成过程中转硫途径，减少H2S的过量生成[24]。目前，近期研究发现CO与CBS血红素区的Fe2+结合可抑制其活性，减少H2S的生成。邵建林等[25]实验中建立大鼠全脑缺血再灌注模型，发现应用CBS抑制剂羟氨后大鼠海马组织CBS mRNA表达减少，H2S生成减少，GSH含量降低，应用HO-1抑制剂锌原卟啉大鼠海马组织HO-1 mRNA表达减少，CO生成减少，但H2S生成增加，GSH含量明显增高。这表明HO-1/CO和CBS/H2S两体系对脑缺血再灌注损伤可能有拮抗作用。

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