禽流感、新城疫血凝抑制试验影响因素分析

2012-03-29蒋作强贵池区动物疫病预防与控制中心247000

当代畜禽养殖业 2012年1期

蒋作强贵池区动物疫病预防与控制中心 247000

车跃光宿州市动物疫病预防与控制中心 234000

血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)由于能同时进行大量样本分析,且因为具有试验过程易于操作以及结果快速、准确等特点而成为我国各地动物防疫监督机构和养殖场进行流行病学调查、免疫程序制定及免疫效果监测等的主要手段之一。尽管此监测方法操作简便、快捷、准确和实用,但是在实践中由于某些因素的影响,也易导致试验结果不准确,甚至无法判定。笔者根据多年的实践操作将实验中的影响因素浅析如下。

1 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)中常见问题。

1.1 对照孔凝集。

1.2 全部凝集。

1.3 红细胞全部下沉。

1.4 标准阳性对照血清的抗体效价与原结果误差大于1个滴度。

1.5 泪滴状流淌(完全血凝抑制)线细。

1.6 结果出现慢或结果出现快，并且整板无凝集现象。

1.7 凝集板出现跳孔现象。

1.8 凝集不明显，无法判定结果。

2 问题产生的可能原因及应对措施

2.1 样品方面

2.1.1 被检血清腐败变性。血样采集后要马上分离血清，分离后及时测定或放置在4℃冰箱内保存，力求新鲜。

2.1.2 受部分禽类血清中非特异性血凝抑制因子影响，尤其是水禽血清在做禽流感血凝抑制试验时会出现对照孔和对照孔后2～3孔有凝集现象。因此，在利用血凝抑制试验进行血清抗体测定之前，有必要对血清中非特异性因子进行排除。

2.2 试剂器材方面

2.2.1 缓冲液配制时间过长，pH值发生变化，使凝集不明显。缓冲液（PBS）尽可能现配现用，浓度和酸碱度要准确，可用HCL和NAOH液调节酸碱度，并用pH试纸测试到pH值合适为止。如果用生理盐水代替缓冲液，要使用新生产、新开瓶的生理盐水。

2.2.2 4个血凝单位(HAU)抗原配制不准确。为防止4个HAU抗原配制不准确，在进行HI试验前必须做4单位抗原校正。即在不加血清的情况下，第1～3孔的血球完全凝集，第4孔50%凝集呈点状，说明4单位抗原的配制可以使用。否则，需重新测定抗原效价，重新配制4个HAU抗原，并做4单位抗原校正，直至结果准确。

2.2.3 红细胞的来源。配制红细胞悬液应采集2只以上成年公鸡的血，一般要求用非免疫公鸡，如果用免疫公鸡代替，应增加洗涤次数和时间。

2.2.4 凝集板不干净。目前，实验单位和基层多使用一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干净。若使用玻璃材料的96孔凝集板，V型孔底需光滑明亮,对底部磨损严重的反应板要及时淘汰，使用后要按程序清洗干净。

2.3 操作方面

2.3.1 在使用微量移液器时，液体加入量发生误差。在使用微量移液器时，每个吸头要安装牢固，防止漏气。操作时手压下的力度要均匀。移液管嘴浸入液面下的深度要力求一致，不可过深，否则留在管嘴外的液体也滴入孔内，吸取量增大，对抗体滴度产生影响。

2.3.2 在稀释血清时，产生气泡。倍比稀释血清时，在吸取第一孔时要先按下移液器，再插入凝集板孔，吸取后加入第二孔。在反复抽取过程中，移液器滴头不要离开液面，防止产生气泡，造成移液量不准。

2.3.3 样品、抗原和红细胞悬液在使用前没有摇匀，加入时浓度高低不一，人为造成误差。因此样品、抗原和红细胞使用前一定要摇匀，保证每一孔中加入的浓度准确一致。

2.3.4 移液器滴加液体时，有时会将管嘴与凝集板孔相接触，造成污染。尤其是在加入红细胞悬液时，孔内已有稀释液、抗原、血清等，如果管嘴接触到孔内混合液，会造成各个孔内液体相互污染。所以在使用移液器时，一定要保持加样器管嘴与凝集板孔间的距离，以保证每个凝集孔内液体数量和浓度准确。

2.3.5 在凝集过程中振动凝集板。有些操作者在实验过程中，急于想知道结果，将凝集板随时取放，使凝集受到影响。因此在静置过程中一定要有耐心，等时间到时再看结果，保证实验的准确性。

2.3.6 抗原与抗体作用时间过长或过短对结果影响较大：过短出现凝集不完全，过长出现洗脱现象。

2.3.7 结果的判定。只有阴性、阳性对照均成立，将凝集板倾斜45度后，流淌呈线状的孔数为血凝抑制效价。

2.3.8 出现重复加样或漏加样的情况。

2.4 实验温度

一般要求在室温25℃～37℃的条件下进行实验。当温度过低，如低于15度时，出现结果就要慢，往往需要超过40分钟才能出现清晰的结果。当实验温度低于4℃时红细胞有时会发生自凝现象。当试验过程中的环境温度超过30℃时，试验结果出现就快，往往在15分钟左右就可读数。一旦时间过长，结果就会消失，使整板无凝集现象。