免疫标记技术在广州管圆线虫病诊断中的应用进展

杨毅梅，张霄霄，崔立云，王 菲，曹淑祯

（大理学院基础医学院，云南大理 671000）

广州管圆线虫（Angiostrongylus cantonensis）是我国陈心陶教授于1933年首次在广州家鼠及褐家鼠发现的〔1〕，随后于1945年、1984年分别在台湾和中国大陆首次报道人感染病例的人兽共患寄生虫〔2-3〕，迄今全世界报道已确诊或疑似感染病例已超过2800例〔4〕。人类因半生食或生食含有三期幼虫的淡水螺或被三期幼虫污染的瓜果、蔬菜以及皮肤接触感染而引起幼虫移行，导致多器官损伤，如嗜酸性粒细胞增多性脊膜炎或脑膜脑炎（eosinophilic meningitis or meningoencephalitis，EM或EME） 等广州管圆线虫病〔5〕，临床及时诊断对广州管圆线虫感染的预防和治疗显得尤为重要。因脑脊液查虫体检出率低下已不能满足临床病原体诊断需要，近年来免疫诊断技术的快速发展，已发展为临床实验室诊断和流行病调查的重要方法之一。本文就近年来广州管圆线虫免疫标记技术应用最新进展进行综述。

1 免疫标记技术概况

免疫标记技术主要通过已知放射核素、酶、荧光素、胶体金或化学发光物等标记物标记抗原或抗体与待测抗体或抗原进行特异反应，通过检测标记物间接计算出目的抗体或抗原的含量。目前常用的有用于组织切片或其他标本中抗原定位的免疫酶染色试验（immunoenzyme staining test，IEST）以及液体标本检测抗原或抗体的酶联免疫吸附 试 验 （enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）、酶联免疫电转移印迹法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，ELIB）、 间接荧光抗体试验（ indirect fluorescent antibody test，IFAT）以及新发展的免疫胶体金技术（immune colloidal gold technique，ICG）等都可应用于广州管圆线虫感染诊断。

1.1 免疫酶染色试验 IEST亦称免疫酶标组织化学法，是采用固相抗原作试验的一种新技术。常规的IEST可分为直接法和间接法。前者固定抗原直接与酶标抗体结合；后者与前者的区别是酶标二抗而进行酶染色。此试验敏感性高，近几十年来国内外将此技术已成功的应用于多种寄生虫感染检测和研究中，并取得了较为满意的结果。

梁浩昆等〔6〕用广州管圆线虫成虫IEST试验对35份感染2周鼠血清和15份4周鼠血清检测分析显示其阳性检出率分别为80.0%与93.3%，总阳性率达84%。黄绪强和朱佩娴等〔7-8〕用广州管圆线虫感染的大鼠肺组织成虫、幼龄期成虫和3期幼虫制成抗原片，用此法分别检测20份、39份感染鼠血清和32份健康大鼠血清，其检测结果表明成虫抗原片IEST的敏感性高达100%和95%，特异性为100%，而且与马来丝虫、猪蛔虫、曼氏迭宫绦虫裂头蚴感染鼠血清、华支睾吸虫及日本血吸虫感染兔血清均无交叉反应。成虫抗原可在-20℃干燥保存11个月，可知此技术不仅灵敏度高、特异性强、无交叉反应，而且可长期保存使用，可作为临床辅助诊断，但此技术抗原需石蜡包埋制作，操作麻烦费时，不适用于大规模现场快速检测。

1.2 酶联免疫吸附试验 目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验，该试验是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判断是否存在免疫反应。目前主要有以检测特异抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Dot-ELISA）、间接ELISA以及检测大分子抗原的双抗夹心ELISA用于广州管圆线虫诊断。

朱佩娴等〔9〕采用Dot-ELISA法检测30只感染广州管圆线虫SD大鼠血清的阳性率为100%，与日本血吸虫和曼氏迭宫绦虫裂头蚴感染大鼠血清无交叉反应，但只在猪蛔虫粗抗原免疫大鼠血清中出现阳性反应。Tomanakan K等〔10〕用同样技术检测30例隐球菌脑膜炎患者、22例细菌性脑膜炎患者、32例嗜酸性粒细胞性脑脊膜炎患者、18例其它寄生虫感染患者和30例健康人血清，只有在嗜酸性粒细胞性脑脊膜炎患者中检出阳性结果，灵敏度为81.3%，其它都为阴性。Ramírez PM等〔11〕报道广州管圆线虫虫卵抗原包被的间接ELISA的敏感性和特异性分别为90.5%和87.0%，但存在交叉反应现象。梁韶晖〔12〕等利用双抗夹心ELISA法检测广州管圆线虫小鼠循环抗原（circulating antigen，CAg）和人血清感染广州管圆线虫CAg，其灵敏度分别为87.2%和86.36%，特异性均为100%。Chen〔13〕等采用同样的方法检测感染广州管圆线虫大鼠、小鼠以及人血清广州管圆线虫CAg的灵敏度和特异度均为100%，而且与日本血吸虫等9种寄生虫无交叉反应。Chye〔14〕等制备分子质量单位为204 ku的广州管圆线虫5期幼虫抗原，利用双抗夹心ELISA法检测42例患有嗜酸性粒细胞增多性脊膜炎或脑膜脑炎的病人血清及脑脊液；在脑脊液查见虫体的病人中血清阳性率为95%（19/20），脑脊液阳性率为85%（17/20）；在未查见虫体的病人中血清阳性率为86.4%（19/22），脑脊液阳性率为81.8%（18/22），40例血清对照组中只有1例阳性，脑脊液对照组均为阴性。

上述研究表明，ELISA方法检测广州管圆线虫灵敏度高，特异性强，完全适用于临床和科研中广州管圆线虫感染的检测，其中Dot-ELISA法可在同一条固相膜上包被多种病原体抗原，可以同时获得广州管圆线虫和其他病原体检测结果，但操作麻烦，不利于流行病学调查。间接ELISA该法只需一种酶标二抗就可以检测多种抗体，但易受到标本其他物质干扰产生假阳性结果。而广州管圆线虫双抗夹心ELISA法则呈现出高特异性、高敏感性及重复性等优点，而且无交叉反应，不仅适合于早期临床诊断而且可以应用广州管圆线虫的流行病学筛查。

1.3 酶联免疫电转移印迹法 ELIB试验是将免疫转印技术与酶标技术两种技术结合应用于分析待检样品复杂抗原成分的新技术，其可更精细分析广州管圆线虫抗原复杂成分，在广州管圆线虫科研中应用广泛。

岳莉莉等〔15〕用此技术对广州管圆线虫雄性和雌性成虫蛋白质分析显示雄虫只有30条区带，雌虫存在40条区带蛋白，约有20种蛋白质具有较强的免疫原性。李华等〔16〕应用此技术对各期广州管圆线虫虫体蛋白分析表明发育各期的虫体蛋白质谱基本一致，无本质区别。因此科研当中不能根据虫体蛋白分析判断虫体发育阶段，但可根据单一抗原的免疫反应特性来判断虫体发育情况。由此可知此技术具有高蛋白分辨能力、检测稳定性高等特性，可广泛应用于广州管圆线虫科研中，与日本血吸虫、曼氏迭宫绦虫裂头蚴抗原免疫以及丝虫等无交叉反应，但仅与猪蛔虫抗原免疫和旋毛虫抗原存在交叉反应〔16-17〕，而其试验成本以及操作复杂等因素不利于临床实验室诊断广州管圆线虫的应用，更不利于流行病学和现场快速诊断。

1.4 免疫荧光技术 免疫荧光技术是异硫氰酸荧光素、罗丹明等荧光素标记抗体或抗原，与待检样本反应，在荧光显微镜下检测标本中抗原或抗体的方法。其主要包括荧光抗体染色和荧光免疫测定两种技术，其中应用于广州管圆线虫抗原定位和检测的主要是IFAT方法。

潘长旺等〔18〕运用IFAT和免疫金银染色试验（immunogold silver staining，IGSS） 对广州管圆线虫的抗原定位进行研究，IFAT的特异性荧光在广州管圆线虫的肠管壁、子宫内虫卵的卵细胞、卵巢和皮层均有显示，而IGSS只在肠管壁有显示，对照试验均为阴性，表明虫体的肠管壁是主要抗原定位器官，为比较两种方法的准确性，以大鼠旋毛虫和肺吸虫抗体阳性血清作对照，用IFAT对广州管圆线虫做交叉试验，结果均未发现皮层有明显荧光，说明IFAT特异性较好。李小龙等〔19〕将此方法检测疑患广州管圆线虫病人血清和健康人群血清显示其检测灵敏性为83%，特异性为100%。而Sandi EA等〔20〕报道此试验检测广州管圆线虫感染的敏感性和特异性分别为93.7%和84.6%，只与粪类圆线虫呈现交叉反应现象。可知此技术不仅可应用于广州管圆线虫科研当中，而且敏感性高，特异性强，也可以应用于临床广州管圆线虫感染的诊断，但需要荧光显微镜观察，此技术不适用于广州管圆线虫流行病学研究和现场快速诊断分析。

1.5 免疫胶体金金标法 ICG是以胶体金为标记物发展起来的固相标记免疫测定技术。此技术快捷、经济、简易操作等优点在临床和现场快速诊断应用广泛。目前应用于广州管圆线虫检测主要有斑点金免疫渗滤试验（dot immunogold filtration assay，DIGFA）、胶体金免疫层析试验（gold immunochromatography assay，GICA）等试验。

曾肖芃等〔21〕包被广州管圆线虫成虫抗原构建广州管圆线虫DIGFA法检测感染鼠血清的阳性率高达96.0%（48/50），健康鼠血清全为阴性，与ELISA法符合率高达96.7%，与蛲虫和绦虫感染鼠血清无交叉反应，但与粪类圆线虫交叉反应率为5.6%。干小仙等〔22〕采用包被广州管圆线虫成虫可溶性抗原的DIGFA法分别检测患者和健康人群血清，其检测敏感性为90.5%，与ELISA检测符合率>90%，与血吸虫病和旋毛虫病交叉反应率分别为3.3%和26.7%，但与并殖吸虫病、囊尾蚴病、华支睾吸虫病和肺结核不存在交叉反应。黄达娜等〔23〕采用包被12D5和21B7单抗点GICA法和双抗（12D5和21B7）夹心ELISA法同时快速检测感染广州管圆线虫大鼠和患者血清CAg，检出率均为100%，与日本血吸虫、肝吸虫、肺吸虫、旋毛虫、蛔虫和包虫病血清均无交叉反应。Chen等〔24〕使用广州管圆线虫GICA法成功地对来自南方五省和北京市流行疫区的1730例血清样本进行流行病学调查分析表明长期从事水产和螺蛳类养殖的男性人群感染广州管圆线虫病的几率相对普通人群风险更高。

免疫胶体金技术是近几年发展的新型快速诊断技术，具有高敏感性和特异性强，操作简单等优点，其检测效能与ELISA相当，在无定量需求情况下，可用此技术替代ELISA检测广州管圆线虫感染，但因包被广州管圆线虫抗原的不同，其检测特异性还有待提高。但此技术无需特殊设备仪器，简单、快捷、易操作，特别适合于临床中小医院广州管圆线虫病感染检测和流行病学调查以及现场快速检测分析。

2 结语

广州管圆线虫是寄生性变温动物，其生长发育易受中末宿主和环境温度的影响，近些年全球变暖，其发病疫源地也随之扩大，特别是人们饮食习惯的改变导致广州管圆线虫病患者呈逐年上升趋势。提高广州管圆线虫的科研水平和临床诊断能力对预防广州管圆线虫病的传播、早期诊断和预后疗效观察显得尤为重要。近些年来新型标记物、反应体系改进、单克隆抗体以及包被技术提高和新材料的应用，免疫诊断技术已发展为广州管圆线虫辅助诊断方法。但抗原抗体存在失活、反应亲和力和特异性不高等原因，导致出现假阳性、假阴性和交叉反应等缺点，但相信随着基因工程特异性抗原的应用，不断改进免疫反应体系和条件，高效标记和包被技术的发展应用，开发出更简便、经济、快速并能诊断区分现症感染和既往感染、评估感染度以及疗效观察的理想免疫学标记技术无疑对广州管圆线虫的预防和诊断治疗具有重要意义。

〔 1〕 Chen HT.Nou Veau nematode Pulmonaire,Pulmonema cantonensis,n.g.n.sp.des rats de Canton〔 J〕 .Ann Parasitol,1935,13(4):312-317.

〔 2〕 Bearucer PC,Rsen L.Memorandium on the first report of Angiostrongylus in man by Normura and Lin,1945〔 J〕 .Am J Med Hyg,1964（ 23）:589.

〔3〕陈晓光，李华.广州管圆线虫病〔J〕.中华传染病杂志，2007，25（ 10） ：637-640.

〔4〕 Wang Q,Li H,Zhou X，et al.Human angiostrongyliasis〔 J〕.Lancet Infect Dis,2008,8(10):621-630.

〔 5〕 李雍龙，管晓虹.人体寄生虫学〔 M〕.7版.北京：人民卫生出版社，2009：190.

〔6〕梁浩昆，王梅英，冯祖梅，等.广州管圆线虫成虫冰冻切片免疫酶染色法检测血清抗体的实验研究〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1992，10（ 3）：227-228.

〔7〕黄绪强，钟权昌，何竟智.免疫酶染色试验检测广州管圆线虫感染鼠血清抗体的敏感性和特异性〔J〕.中国人兽共患病杂志，1994，10（ 1）：28-29.

〔8〕朱佩娴，伍金满，孔如静，等.免疫酶染色试验检测广州管圆线虫病鼠血清抗体的实验研究〔J〕.暨南大学学报：医学版，1994，15（ 4）：9.

〔9〕朱佩娴，熊钟谨，吴春云，等.用Dot-ELISA检测广州管圆线虫抗体的研究〔 J〕.中国人兽共患病杂志，2002，18（ 5）：51-53.

〔 10〕 Tomanakan K,Srisurach N,Sae-tung S,et al.Detection of Circulating Antibody of Parastrongylus cantonensis in Sera with Eosinophilic Meningitis by Dot-Blot ELISA〔 J〕.J Med Assoc Thai,2008,91（ 7）:1082-1086.

〔 11〕 Ramírez PM,Sandí EA,Quesada KF,et al.Angiostrongylus costaricensis egg antigen for the immunodiagnosis of abdominal angiostrongyliasis〔 J〕 .J Helminthol,2008,82:251-254.

〔12〕梁韶辉，潘长旺，谭峰，等.双抗体夹心ELISA法测人体广州管圆线虫循环抗原的研究〔J〕.中国人兽共患病杂志，2005，21（ 10） ：880-882.

〔 13〕 Chen MX,Wang K,Ai Lin,et al.Development of a double antibody sandwich ELISA assay for the diagnosis of angiostrongyliasis〔 J〕 .J Parasitol,2011,97(4):721-724.

〔 14〕 Chye SM,Yen CM,Chen ER.Detection of circulating antigen by monoclonal antibodies for immunodiagnosis of angiostrongyliasis〔 J〕 .Am J Trop Med Hyg,1997,56:408-412.

〔15〕岳莉莉，梁浩昆，冯祖梅，等.免疫印迹法分析广州管圆线虫成虫抗原的探讨〔J〕.中国寄生虫病防治杂志，1991，4（ 3） ：220.

〔16〕李华，陈晓光，沈浩贤，等.不同发育阶段广州管圆线虫的抗原分析〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23（ 1） ：36-39.

〔17〕伍金满，朱佩娴，熊钟瑾，等.酶联免疫印迹技术分析广州管圆虫雌虫抗原〔J〕.中国人兽共患病杂志，1996，12（ 6）：26-28．

〔18〕潘长旺，梁韶晖，黄慧聪，等.广州管圆线虫的抗原定位研究〔 J〕.中国寄生虫病防治杂志，2001，14（ 3）：192-193.

〔19〕李小龙，陶洪群，陈晓东，等．间接荧光抗体试验检测广州管圆线虫病〔 J〕．中国人兽共患病杂志，2000，16（ 2）：65-66.

〔 20〕 Sandi EA,Ramírez PM,Chacón DS,et al.An indirect immunofluorescence antibody test employing whole eggs as the antigen for the diagnosis of abdominal angiostrongyliasis〔 J〕 .Mem Inst Oswaldo Cruz,Rio de Janeiro,2011,106(4):390-393.

〔21〕曾肖芃，丁建祖，沈丽英，等.滴金免疫渗滤法检测广州管圆线虫抗体的实验研究〔J〕.热带医学杂志，2007，7（ 3）：205-206.

〔22〕干小仙，王越，杨发柱，等.金标法检测广州管圆线虫特异性IgG抗体的研究〔 J〕.中国人兽共患病学报，2007，23（ 4）：345-347.

〔23〕黄达娜，陈木新，耿艺介，等.应用12D5和21B7单克隆抗体检测广州管圆线虫循环抗原的研究〔J〕.中华流行病学杂志，2010，31（ 1）：79-81.

〔 24〕 Chen MX,Zhang RL,A L,et al.Seroprevalence of Angiostrongylus cantonensis infection in humans in China〔 J〕.J.Parasitol,2011,97（ 1） ：144-145.