钙结合蛋白S100A6与肿瘤和细胞信号转导的相关研究进展

李 晖，关宏伟

(1.郑州大学 西亚斯国际学院 护理学院，河南 新郑 451150；2.大连医科大学 附属第一医院 病理科，辽宁 大连116011)

S100蛋白家族是一类非泛素化、EF-手型钙结合蛋白，通过与钙离子及靶蛋白的相互作用，在体内发挥多种生物学作用，参与细胞周期活动、细胞分化、肿瘤生长以及细胞外基质分泌活动等过程，其分布具有细胞、组织特异性。其多个成员在肿瘤中表达异常，并与肿瘤的增殖、浸润转移和凋亡密切相关[1]，其中包括S100A6。S100A6又称为钙周期蛋白(Calcyclin，Cacy)，过去也称为2A9、5BlO、PRA和CACY。

1 S100A6蛋白概述

1.1 S100A6的发现及基因的染色体定位

S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrlich腹水瘤中检出，它在细胞内广泛分布，主要存在于胞质、胞膜以及核被膜上，包括核膜的内表面；其分布受细胞分裂状态和钙离子浓度的影响，当改变细胞内钙离子浓度时，S100A6的分布也会发生改变，与细胞进入S期有关[2]。

S100A6基因位于人染色体的lq21的250～350 kb之间，并与S100A1～5、S100A7～10，S100C等S100基因家族成员和表皮分化基因共同位于1750 kb区域之间[3]。S100A6基因与原癌基因ski毗邻。

1.2 S100A6基因结构及基因表达机制

1.2.1 S100A6的基因结构

S100A6(GenBank accession number，M18981)是单拷贝基因，又称为催乳素受体相关蛋白(prolactin receptor-associated protein，PRA)，包含3个外显子，被2个内含子所分隔。全长共470个核苷酸，起始密码TGA位于103 bp处，终止密码位于373 bp处。因此开放阅读框为270个核苷酸，共编码90个氨基酸。

1.2.2 S100A6的基因表达机制

为了研究S100A6在细胞中特异性表达的分子机制，首先对其基因启动子做了相关研究。研究发现，两个E-box元件在S100A6启动子的转录调控中发挥作用。其序列分别位于S100A6基因启动子的-283/-278和-593/-588位置。运用电泳迁移率变动分析法(EMSA,electrophoretic mobility shift assay)和染色质免疫沉淀法(chromatin immunoprecipitation)检测显示，转录因子中的上游刺激因子1(USF1)与两个E-box调节元件结合增强了S100A6启动子的转录活性[4-5]。同时发现，引起氧化应激的因子例如镉离子使S100A6基因活化，但引起氧化应激的因子一旦与位于S100A6基因启动子-290/-281的突变的抗氧化应答元件(ARE,antioxidant response element)结合，由于该元件覆盖了可被USF识别的E-box序列，可导致S100A6基因启动子活性被抑制[6]。由此推测，S100A6的表达可能对通过转录因子识别启动子调控位点作用的信号途径做出了应答。

目前，通过对外遗传标记物即S100A6基因甲基化和组蛋白变更体检查显示，这一由重亚硫酸盐修饰的DNA序列长3247 bp，包含了启动子/第一个外显子CpG区域，S100A6基因的编码序列和一段下游区域，该段序列显示它们在S100A6表达阳性的细胞中呈现非甲基化，例如在淋巴细胞和人表皮样癌(Hep-2),而在不表达S100A6的胚胎性上皮细胞(HEK293)中则表现为甲基化。运用染色质免疫沉淀法检测出在组蛋白H3乙酰化和甲基化的水平上以及体内分别表达S100A6阳性和阴性的细胞中与S100A6基因启动子结合的USF数量上都存在差异。由此证明，S100A6的细胞特异性表达也是在外遗传控制的机制下进行的[7]。

1.3 S100A6蛋白功能

S100蛋白成员是多功能信号蛋白，参与调控多种细胞的活动。细胞内的S100蛋白可增强物质代谢(作用于肌球蛋白重链)、促进细胞骨架的解聚作用(作用于微管蛋白)，参与胞吞作用和胞吐作用，调节腺苷酸环化酶的活性，影响转录。细胞产生的S100蛋白分泌到细胞外可以激活钙离子通道，增强趋化效应，促进细胞外基质蛋白相互作用[8]。S100A6与S100蛋白家族其他成员间存在结构上的同源性，因此，S100A6也参与这些过程。

S100A6还具有调控蛋白的磷酸化和促进细胞凋亡的作用。CacyBP是S100A6的靶蛋白之一，它与S100A6结合呈Ca2+依赖的形式。最新的研究发现，一种新的酵母蛋白Sgt1与CacyBP有20%的同源性，其中C末端与CacyBP相似，是S100蛋白结合部位[9]。在酵母中Sgt1可以与Skp1(SCF泛素连接酶和着丝粒复合物的成分之一)结合，Sgt1结合的SCF复合物包括β-TrCP蛋白，是β-catenin降解的经典泛素连接酶复合物(SCFβ-TrCP)。S100蛋白能与Sgt1结合，Sgt1的S100结合域可以被酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化，而S100A6的结合能抑制这种磷酸化，所以S100A6对Sgt1磷酸化的调控可能是S100-Sgt1相互作用的生理功能[10]。为阐明S100A6在细胞凋亡过程中的作用，构建含有S100A6基因模板链或反义链的质粒载体转染体外培养的Hep3G细胞后，Ca2+载体处理剂A23187处理细胞诱导凋亡条件，发现S100的过表达使Hep3G对处理剂诱导的细胞凋亡更加敏感[11]。与此相反，与无处理对照组细胞或转染有S100A6基因模板链质粒的阳性细胞相比，转染有S100A6反义链质粒的细胞细胞存活力较高，DNA断裂程度较低，G1期/G0期细胞数降低。同一实验还发现与无处理组细胞相比，阳性表达S100A6的Hep3G细胞中细胞凋亡相关分子Caspase-3(半胱天冬酶-3)活性增强，而在表达S100A6阴性细胞中活性降低。这说明S100A6表达增多通过增强Caspase-3活性影响诱导细胞的细胞凋亡。进一步运用RT-PCR,Western-blot和Caspase-3启动子分析检测发现随着S100A6含量水平增高，Caspase-3表达水平也呈一定比例增高，而其他凋亡相关因子如Caspase-6，Caspase-7，Caspase-8，Caspase-9，Bcl-2，Bax等表达水平未见差异性变化。以上结果均暗示，S100A6可能以Caspase-3转录活化剂的形式参与促进了细胞凋亡。

2 S100A6与肿瘤

2.1 S100A6在肿瘤中异常表达

在大多数肿瘤组织中S100A6表达均有增高[12]，它的异常表达与细胞的增殖和分化密切相关，当静止细胞在生理或病理条件下受到血清、表皮生长因子、血小板源生长因子、神经生长因子、视黄酸、缺血性损伤等刺激时，胞内S100A6的表达会有显著的升高[13]。据文献报道，在ras转化的NIH3T3细胞、SV4O转化的鼠成纤维细胞、人急性粒细胞白血病、人子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌、结直肠肿瘤、甲状腺肿瘤、恶性纤维组织瘤、黑色素细胞瘤、神经母细胞瘤、口腔黏膜的鳞状细胞癌、各种类型的皮肤肿瘤以及上皮来源的肿瘤细胞系等多种增殖旺盛的细胞中，S100A6均高表达[14]，高于同种的分化/生长受抑的细胞。众多研究表明，与S100A6相关的几种蛋白质，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶、原肌球蛋白、P30、膜联蛋白Ⅺ等，与S100A6相互作用形成的复合物参与细胞的增殖。

2.2 S100A6与肿瘤转移的关系

现今S100A6在黑色素瘤和结直肠肿瘤中表达异常的研究较多。Maelandsmo等[15]报道，S100A6的mRNA、蛋白表达水平在人转移黑色素瘤中一般高于良性痣，但在这两种组织中S100A4没有明显差别，故被认为是黑色素瘤细胞的肿瘤标记物。S100A6的高表达还与黑色素瘤细胞的转移能力呈正相关，并与患者存活期相关，低表达患者存活时间明显长于高表达患者。Komatsu等[16]报道，S100A6在转移性结直肠腺癌细胞中的表达是可逆的，当癌细胞在转移结节中心重新构建细胞与细胞之间的联结后，其表达水平下降。S100A6、S100A8、S100A9多聚集于肿瘤的边缘，故推测它们可能与肿瘤的侵袭性有关。Vimalachandran等[17]证实，胰腺癌患者的肿瘤细胞核内高度表达S100A6 与其低生存率密切相关。但Hue等[18]研究S100A6与人骨肉瘤的关系时发现，高度表达的S100A6能限制肿瘤的转移，并抑制肿瘤细胞的成长，这一点似乎与以往的研究结果有所出入。

他们的研究还证实，高度表达S100A6的骨肉瘤患者其生存时间远比低表达S100A6 的生存时间长，其中潜在的机制尚未被阐明。看来S100A6在肿瘤中的表达与肿瘤的转移性之间的关系需要进一步的研究。

3 S100A6与细胞信号转导

3.1 S100A6调节Sgt1与Hsp70和Hsp90的相互作用

Sgt1作为一种在与Skp1蛋白相互作用过程中能够活化CBF3着丝粒和SCF泛素连接酶复合体的蛋白由Kitagawa等人首先在酵母中发现[19]。Sgt1蛋白由三个主要结构域组成，即Sgt1的C端部分，N端部分和中心部分。其C端部分也称为SGS区域，这一区域在其所有亚型和同系物Cacy-BP/SIP中的表达都是统一的。人类Sgt1蛋白的SGS区主要用来与S100家族中的一些钙离子结合蛋白相互作用[20]。Sgt1蛋白的N端包含了TPR区，此区在除Sgt1之外的其它蛋白中与某些分子伴侣蛋白相互作用[21]。事实上，研究显示Sgt1的N端部分主要参与与Hsp90的结合[22-23]。Sgt1的中心部分称为CS区，用于与其它一些CS区包含蛋白相互作用[24]。最近文献报道，人类Sgt1蛋白的CS区在体内与分子伴侣蛋白Hsp90相互作用而不是TPR区[25]。分子伴侣作为一种主要驱动蛋白在许多细胞性活动中如蛋白质折叠与成熟，蛋白水解，DNA复制和转录中发挥重要作用。Hsp70型分子伴侣参与对天然蛋白构象的稳定过程以及部分已折叠蛋白质在顺应应激条件下的重折叠和解聚过程[26]。Hsp90的功能虽然较Hsp70来说比较局限，但已证实它在保护蛋白抵抗外来应力的过程中发挥了重要作用[27-28]。

为研究Sgt1能够与包含Hsp90在内的其它分子伴侣蛋白相互作用，分别运用三种不同的检测方法进行实验：免疫共沉淀法，亲和层析法和ELISA法。运用免疫共沉淀法在转染了编码Sgt-FLAG质粒的HEP-2细胞用配有抗-FLAG抗体的琼脂糖免疫沉淀Sgt1-作用蛋白，洗脱蛋白联合体，在SDS胶上进行分离，分别用抗FLAG标签抗体，抗Hsp70抗体，抗Hsp90抗体对其进行免疫印记分析。结果显示，Hsp70和Hsp90都与Sgt1相互作用而被沉淀下来，同时，在阴性对照细胞以及转染了只编码FLAG标签质粒的细胞中，由于非特异性结合显示较明显的背景染色。值得注意的是，在用Hsp90抑制剂-radicicol孵育的细胞中，未见Hsp90条带，而Hsp70条带却更加明显。运用亲和层析法通过对HEp-2细胞提取物中上清液进行分离，以不做任何处理和用radicicol进行处理作为两种样本都运用于加有Tris以封闭非特异性结合的琼脂糖凝胶树脂，未联合部分运用于含有Sgt1的琼脂糖树脂。结果显示，不管在未处理细胞还是用radicicol处理过的细胞中，Hsp70都能与琼脂糖凝胶中的Sgt1结合，而Hsp90蛋白只在未处理细胞的洗脱液中检测到。运用ELISA法将重组蛋白Hsp70或Hsp90包被于96孔板中，逐步加入重组蛋白Sgt1，抗Sgt1抗体后对反应液进行色度分析。结果显示，Hsp70和Hsp90的α和β亚基与Sgt1蛋白相互作用。以上三种不同检测方法均证明，Sgt1与分子伴侣蛋白Hsp70存在相互作用。

早期研究发现，Sgt1的C端即SGS区，存在263～333个氨基酸残基，能够以一种Ca2+依赖方式与S100A6结合[21]。为研究S100A6对Sgt1-Hsp90和Sgt1-Hsp70相互作用的调节，分别对转染有编码Sgt1-FLAG质粒的细胞和转染有编码S100A6质粒的细胞提取蛋白，用配有抗-FLAG标签抗体的琼脂糖凝胶对两种细胞蛋白做免疫沉淀检测。结果显示，S100A6的过表达或表达增高降低了与Sgt1蛋白结合的Hsp90和Hsp70的结合量。用经钙离子螯合剂BAPTA/AM处理过的细胞做同样实验发现，与Sgt1蛋白结合的Hsp90或Hsp70的量与转染有只编码Sgt1-FLAG质粒的细胞和转染编码S100A6基因质粒的细胞中结合Sgt1的Hsp90，Hsp70蛋白量相近。这个结果暗示了S100A6通过Ca2+依赖方式结合到Sgt1的C端从而调节Sgt1与分子伴侣蛋白的相互作用。

3.2 S100A6能够增强Wnt/β-catenin信号途径的活性

Wnt/β-catenin信号途径的异常激活与肿瘤的发生发展有着密切的关系，但其异常激活的机制尚未阐明。为了解Wnt/β-catenin信号途径失调的原因和机制，人们开始研究β-catenin及其上游基因的调控机制[29-31]。

将含有人S100A6基因的pHAHA—hS1006质粒中的hS100A6亚克隆到pGST-Moluc和pAdTrack-CMV中，构建pGST-Moluc-hS100A6 和 pAdTrack-CMV-hS1006，用pGST-Moluc-hS100A6转化表达宿主大肠杆菌BL21，诱导表达和分离纯化该融合蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。 用空载体pGST-Moluc同时制备GST融合蛋白作为对照。结果显示，诱导后重组菌的总蛋白经SDS-PAGE后，分别在36 000和26 000处有一条明显增粗的条带且与GST一S100A6融合蛋白和GST的分子量相符，谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠混悬液亲和层析分离纯化，测定蛋白纯度为92%。

接种人骨肉瘤细胞株MG63和结肠癌细胞株HCT116细胞于12孔板，待细胞融合达50%～60%时，加入表达有hS100A6的重组腺病AdS100A6(以AdGFP为对照)，荧光显微镜下观察腺病毒感染率，并分别于48、72 h收集细胞。SDS-上样缓冲液裂解细胞，离心收集裂解液上清，紫外分光法进行蛋白定量后行SDS-PAGE和Western blot分析。分别加入一抗兔抗人β-catenin多克隆抗体(1：500)和β-actin(1：200)，二抗羊抗兔IgG(1：5000)。ECL试剂盒检测结果，Gel Doc凝胶成像仪采集图像，定量分析软件测定各条带灰度值。Western blot结果显示，在AdS100A6感染48、72 h后，MG63和HCT116细胞中β-catenin的表达均较对照组明显增加；同时，以β-catenin为内参对照，进一步验证AdS100A6作用HCT116细胞48 h后β-catenin变化，该组灰度值是对照组的2.1倍。提示S100A6能增加MG63和HCT116细胞β-catenin的水平。

将人胚胎肾细胞株HEK293细胞接种于12孔板，常规培养，待细胞融合度达70%～80%时，用脂质体PolyFect将报告子基因质粒pTOP—Luc转入细胞中，16 h后分别加入终浓度为40 μg/mL的GST-S100A6和GST，36 h后收集细胞裂解液上清进行蛋白定量。取总蛋白为20 μg的细胞裂解液上清与100 μL荧光素酶检测试剂反应，以pFop-luc为阴性对照，用多功能酶标仪检测荧光素酶活性，并以此来反映细胞内转录复合物β-catenin/T细胞因子4(TCF4)的转录活性[30]。结果显示，GST-S100A6能够增加转染Ptop-Luc的HEK293细胞的荧光素酶活性20.2倍，但对转染Pfop-Luc的HEK293细胞的荧光素酶活性无影响，且GST对照组与空白对照HEK293细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义。提示S100A6能够特异性上调β-catenin/TCF4的转录活性。

电穿孔法分别将质粒pcDNA-GSK-3β-HA、pCMV-Dvl-Myc和pCMV-Axin-Myc转染对数生长期的HEK293细胞，培养36 h后收获富含GSK-3β-HA、Dv-Myc和Axin-Myc的细胞裂解液上清；直接裂解HEK293细胞获得含β-catenin的细胞裂解液上清。细胞裂解液上清均用谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠进行预清洁，以清除与球珠非特异吸附的蛋白。预清洁后的细胞裂解液上清各100 μL与10 μg GST—hS100A6在冰浴中孵育1 h后加入15 μL谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠，在冰浴中翻转摇动孵育3 h，4℃离心收获球珠，洗涤3次后加入等体积1倍的SDS-上样缓冲液，煮沸5 min，进行SDS-PAGE和Western blot分析。以GST为阴性对照，以富含GSK-3B-HA、Dv1-Myc、β-catenin和Axin-Myc的细胞裂解液上清为阳性对照。结果显示，各阳性对照组，GST-S100A6-β-catenin组，GST-S100A6-GSK-3β-HA组和GST-S100A6-Dvl-Myc组均有特异性杂交条带出现；而GST-S100A6-Axin-Myc组和各GST对照组则未出现特异性条带。提示S100A6与β-catenin，GSK-3β和Dvl在体外可能存在着某种直接的相互作用，而与Axin之间并无直接相互作用。由此推测，S100A6与β-catenin的直接相互作用可能会直接抑制β-catenin的降解，导致其在胞浆内的水平增加，从而使Wnt/β-catenin信号途径活性[32-33]的活性增强；在人类肿瘤中，尚未检测到GSK-3β的基因突变，但其活性可下调。对于S100A6与其的直接相互作用可能是通过实现对其活性的调节，从而抑制β- catenin的磷酸化，使β-catenin降解受阻而致胞浆内水平增加。Dvl蛋白是该信号的正性调节因子，具有DIX，DEP和PDZ三个结构域，其中PDZ域能与EF手型基序以钙非依赖方式结合[34-35]，这可能是Dvl与S100A6之间直接相互作用的结构基础。这种相互作用可能通过促进Dvl的功能，从而抑制β-catenin的磷酸化依赖性降解，导致Wnt/β-catenin信号途径的活性增强。

β-catenin是Wnt/β-catenin信号途径中的关键分子，其在胞浆内的表达水平决定着β-catenin/TCF-4的转录调节活性，从而影响着该信号途径的活性。结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,APC)，GSK-3β，Axin和Dvl可调节细胞内β-catenin的磷酸化依赖性降解水平，其中前三者是促进降解，后者是抑制降解。由于这些分子的异常表达所导致的β- catenin磷酸化依赖性降解受阻，使胞浆内β-catenin累积并进入细胞核内与TCF4结合，从而使β-catenin/TCF4的活性增高，信号途径活性增强[34-35]。S100A6能增加β-catenin的表达水平并上调β-catenin/TCF4活性，提示S100A6具有增强Wnt/β-catenin信号途径活性的作用，这可能正是S100A6参与肿瘤发生发展的机制之一。

4 展 望

S100A6作为一种钙结合蛋白，在细胞信号转导过程中发挥重要作用，尽管对其性质以及结构等方面有了一定的了解，但不够全面，在以后的研究中有待进一步拓展，特别是在细胞增殖、凋亡，肿瘤发生、浸润和转移等过程中的生物学作用机制；与S100蛋白家族中其他成员的关联和相互协同作用；利用反义核酸技术阻断S100A6的表达是否可以抑制肿瘤的转移和复发；靶蛋白分子的鉴定等方面。随着蛋白质组学方法、生物信息学工具以及基因芯片、RNA干扰、小RNA等分子生物学技术的应用及改进，S100A6基因的表达和生物学功能会逐步明朗化，有望应用于肿瘤及其转移的早期检测、诊断和治疗。

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