线粒体蛋白质组学在肿瘤研究中的进展

凌孙彬，唐 博，王立明

(1.大连医科大学 七年制2007级，辽宁 大连 116044；2.大连医科大学 附属第二医院 普外三科，辽宁 大连 116027)

近年来，蛋白质组学的发展为肿瘤研究提供了全新的方法和思路，细胞水平的肿瘤蛋白质组学研究得到了广泛的开展，但是，现有分离技术下往往难以一步到位地获得细胞的全蛋白质组，大量的低丰度蛋白质未能得到显现和分析。因此，亚细胞蛋白质组学的开展可以作为传统蛋白质组学的重要补充，同时也极大地降低了针对全细胞蛋白质组学研究的复杂性。线粒体(mitochondria，Mt)是真核细胞中一种重要的细胞器，除作为能量产生的场所外，已发现其参与包括肿瘤细胞发生发展在内的多种病理生理过程[1]。线粒体蛋白质组学已被运用于部分肿瘤的研究中，进一步阐明线粒体蛋白质与肿瘤的关系，有助于寻找新的肿瘤相关特异性蛋白。本文就线粒体蛋白质组学在肿瘤研究中的进展进行综述。

1 线粒体蛋白质组学概述

线粒体蛋白质组学的研究主要集中在两方面：(1)线粒体蛋白质表达谱的建立；(2)运用比较蛋白质组学的方法寻找疾病组和对照组的差异表达蛋白，研究蛋白质表达量的变化、翻译后修饰以及细胞内定位改变等。线粒体蛋白质组研究常用技术包括：(1)用于蛋白质分离纯化的双向凝胶电泳(2DE)、二维液相色谱(2D-LC)以及常用于亚细胞分离的差速离心和密度梯度离心技术；(2)蛋白质鉴定技术:质谱技术(MS)、凝胶图像分析、蛋白质测序及氨基酸组成分析等；(3)用于蛋白质相互作用及作用方式研究的酵母双杂交系统、亲和层析和蛋白质芯片技术等；(4)生物信息学。

目前，对复杂蛋白质的分析一般有两条技术路线：经典的双向凝胶电泳-质谱技术(2-DE-MS)和二维液相色谱-串联质谱(2D LC-MS/MS)。2-DE-MS可以反映蛋白质分子的分子质量、等电点、疏水性以及结合特性，而对低丰度、极端分子量、碱性、疏水性蛋白的分辨率低。线粒体是一个具有双层膜结构的细胞器，内膜和外膜上整合有很多膜蛋白质，这些膜蛋白质对于线粒体功能的发挥具有重要作用，但是膜蛋白质具有很强的疏水性， 2DE-MS对线粒体蛋白的分离有局限性。2D LC-MS/MS可以弥补经典策略的不足，不受蛋白质等电点、分子量、疏水性的限制，且自动化程度高。Pflieger等[2]应用LC-MS/MS成功的鉴定出179种线粒体蛋白质，其中43%是膜蛋白质而且23%具有跨膜结构域。2D LC-MS/MS主要的不足在于提供的关于完整蛋白质的分子信息非常有限，尤其是有关翻译后修饰的信息量较少。目前对线粒体分离纯化的技术主要为差速离心结合密度梯度离心，该技术可以减少样品污染，同时较好地保护线粒体不受破坏[3-4]。此外，本实验室采用以磁性纳米粒子为介质的线粒体分离技术，得到了更高的分离率和纯度。

2 线粒体与肿瘤的关系

线粒体(mitochondria，Mt)是细胞中进行生物氧化和能量转换的细胞器，含有1000～2000种蛋白质, 约占整个细胞蛋白质种类的5%～10%，在这些蛋白质中，有2%是线粒体自己合成的，98%是由细胞核编码、细胞质核糖体合成后运往线粒体的，因此，线粒体是一种半自主性的细胞器。线粒体不仅维持细胞的正常生理功能，还在信号转导、细胞凋亡、自由基生成、细胞内离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控中发挥重要的作用。线粒体有自己的遗传系统和蛋白质翻译系统，人线粒体DNA(mtDNA)是一个16 569 bp的双链环状闭合分子，编码13种蛋白质，22种tRNA和2种rRNA。D环(D-loop)是mtDNA主要的非编码区，包含了线粒体基因复制和转录的调控序列，其中央保守区呈现高度保守性[5]。mtDNA突变和线粒体本身功能的异常与肿瘤的发生发展和细胞凋亡密切相关[6]。mtDNA易受损伤，突变率远高于nDNA。mtDNA突变常发生于D-loop区，D-loop区控制着mtDNA的复制和转录，可引起mtDNA拷贝数的改变和某些基因的异常表达[7]。早在1956年，Warburg[8]提出线粒体呼吸链的缺陷可以导致细胞去分化，并因此促进细胞癌变，而最近认为mtDNA的突变可以引起线粒体呼吸链的异常，进而导致肿瘤发生[9-10]。线粒体还参与细胞凋亡过程，其功能的异常能使肿瘤细胞获得较强的抗凋亡能力[11-12]，一些特异性定位于线粒体的肿瘤相关因子，也被发现参与对肿瘤细胞生长及凋亡的控制[13-14]。

3 线粒体蛋白质组学在肿瘤研究中的进展

3.1 线粒体蛋白质组学用于肿瘤差异蛋白的筛选

目前，仍有大量的线粒体蛋白未被鉴定，基于线粒体与肿瘤的相关性，线粒体蛋白质组学在肿瘤研究中显示出重要意义。Hermann等[15]采用蛋白质组学技术定量分析了线粒体和核分别编码的细胞色素C氧化酶(COX)亚单位间的比率，发现该比率与前列腺组织恶性进程相关。该研究说明了核编码线粒体蛋白质在肿瘤发生中发挥了重要作用，同时也显示出对完整线粒体蛋白质组鉴定的重要意义。Kim等[16]采用蛋白质组学技术分析了人胃癌细胞系AGS，发现了4种高表达线粒体蛋白质：泛醇-细胞色素C还原酶(ubiquinol-cytochrome C reductase)、烯酰辅酶A水合酶-1短链(mitochondrial short-chain enoyl-coenzyme A hydratase-1)、HSP6、线粒体延伸因子T(mitochondria elongation factor T)，这些蛋白可能成为存在于肿瘤细胞线粒体上的生物标记物。中国Li等[17]在对肝癌亚细胞结构的蛋白质组比较分析中，发现了14个差异表达的线粒体蛋白质，包括参与细胞能量代谢的相关酶类、细胞骨架蛋白及蛋白质代谢相关蛋白，说明线粒体参与肿瘤发生发展的多个过程。最近，Chen等[18]在对3种恶性程度和侵袭潜能不同的乳腺癌细胞系的线粒体差异蛋白质组学分析中，发现了新的具有诊断意义的相关蛋白。

3.2 线粒体蛋白质组学用于肿瘤耐药相关蛋白的筛选

肿瘤细胞的耐药性与细胞内凋亡机制的异常改变密切相关，而线粒体对肿瘤细胞凋亡的调控可直接影响其耐药性。Jiang等[19]比较了非霍奇金淋巴瘤(NHL)拉吉细胞(Raji cells)阿霉素(ADR)培养与正常培养细胞株之间线粒体蛋白的表达差异，发现了ADR培养的细胞线粒体中热休克蛋白70(HSP70)、抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)和人腺苷三磷酸结合盒转运体B6(ATP-binding cassette transporter isoform B6，ABCB6)的异常表达。HSP70可抑制细胞内氧化应激和细胞凋亡，其高表达常提示肿瘤患者预后不良[20]； ABCB6定位于线粒体外膜，与细胞内的物质运输有关，它的异常表达可能影响细胞内稳态，从而起到促肿瘤和肿瘤细胞多药耐药等作用，但具体机制仍不清楚[21]；PHB可能通过与Rb蛋白(retinoblastoma protein)作用，抑制转录因子E2F的活性，抑制肿瘤细胞凋亡[22]。但是，最近Dai等[23]采用差示凝胶电泳(DIGE)技术分离样品，比较了铂类化疗药敏感的卵巢癌细胞系SKOV3、A2780和铂类化疗药不敏感的卵巢癌亚细胞系SKOV3/CDDP、SKOV3/CBP、A2780/CDDP、A2780/CBP之间线粒体蛋白质表达谱的差异，发现在耐药细胞系线粒体中有PHB表达的显著下调，认为卵巢癌细胞的耐药性与线粒体中PHB的低表达有关。PHB被认为定位于细胞核、线粒体内膜等处，上述现象可能与PHB在不同细胞内的定位差别以及不同的线粒体分离技术有关；同时，PHB的功能也存在争议，以上研究至少可以说明亚细胞分离技术在研究细胞内广泛定位的蛋白时的重要作用。另外，Jiang等[24]还分析了耐放疗NHL拉吉细胞株的线粒体蛋白质组，鉴定出了23种差异表达蛋白，其中GAPDH、RECQL4、MKI67和ATAD3B可能作为肿瘤细胞耐受放疗的潜在标记物。

4 展 望

由于有两套相对独立的蛋白质编码系统的存在以及线粒体与细胞凋亡、信号转导等功能的密切相关性，线粒体基因和蛋白水平上的变化极易引起细胞功能的紊乱。在肿瘤的发生、发展过程中，细胞线粒体本身数量与功能的改变也会引起相关蛋白含量的变化。目前，线粒体蛋白质组学的研究和应用仍不广泛，但是，既往的研究已经体现出线粒体蛋白质组学技术在肿瘤研究中的价值，随着蛋白质组学技术的不断发展，尤其是亚细胞分离技术的进步，线粒体蛋白质组学将成为肿瘤研究中新的热点。

[1] Maximo V,Lima J,Soares P,et al.Mitochondria and cancer[J].Virchows Archiv,2009,454(5):481-495.

[2] Pflieger D,Le Caer JP,Lemaire C,et al.Systematic identification of mitochondrial proteins by LC-MS/MS[J]. Anal Chem,2002,74(10):2400-2406.

[3] Zhang J,Li X,Mueller M,et al.Systematic characterization of the murine mitochondrial proteome using functionally validated cardiac mitochondria[J].Proteomics,2008,8(8):1564-1575.

[4] Elena S,Assunta L,Daniela G,et al.Mammalian mitochondrial proteome and its functions:Current investigative techniques and future perspectives on ageing and diabetes[J].JIOMICS,2011,1(1):17-27.

[5] Kang D，Hamasaki N.Mitochondrial oxidative stress and mitochondrial DNA[J].Clin Chem Lab Med,2003,41(10):1281-1288.

[6] Modica-Napolitano JS,Kulawiec M,Singh KK.Mitochondria and human cancer[J].Curr Mol Med,2007,7(1):121-131.

[7] Lee HC,Li SH,Lin JC,et al.Somatic mutations in the D-loop and decrease in the copy number of mitochondrial DNA in human hepatocellular carcinoma[J].Mutat Res,2004,547(1-2): 71-78.

[8] Warburg O.On respiratory impairment in cancer cells[J].Science,1956,124(3215): 269-270.

[9] Habano W,Sugai T,Nakamura SI,et al.Microsatellite instability and mutation of mitochondrial and nuclear DNA in gastric carcinoma[J].Gastroenterology,2000,118(5):835-841.

[10] Gasparre G,Porcelli AM,Bonora E,et al.Disruptive mitochondrial DNA mutations in complex I subunits are markers of oncocytic phenotype in thyroid tumors[J].Pro Natl Acad Sci USA,2007,104(21):9001-9006.

[11] Baysal BE.Role of mitochondrial mutations in cancer[J].Endocr Pathol,2006,17(3):203-212.

[12] Shen L,Lan Z,Sun X,et al.Proteomic analysis of lanthanum citrate-induced apoptosis in human cervical carcinoma SiHa cells[J].Biometals,2010,23(6): 1179-1189.

[13] Spänkuch-Schmitt B,Bereiter-Hahn J,Kaufmann M,et al.Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1 (PLK1) on apoptosis and spindle formation in human cancer cells[J].J Natl Cancer Inst,2002，94(24):1863-1877.

[14] Elhasid R,Sahar D，Merling A,et al.Mitochondrial pro-apoptotic ARTS protein is lost in the majority of acute lymphoblastic leukemia patients[J].Oncogene,2004,23(32): 5468-5475.

[15] Herrmann PC,Gillespie JW,Charboneau L,et al.Mitochondrial proteome:altered cytochrome c oxidase subunit levels in prostate cancer[J].Proteomics,2003,3(9):1801-1810.

[16] Kim HK,Park WS,Kang SH,et al.Mitochondrial alterations in human gastric carcinoma cell line[J].Am J Physiol Cell Physiol,2007,293(2):C761-C771.

[17] Li Xing,Pan Wei,Qiu Feng,et al.Comparative proteome analysis of hepatoma cells at subcellular level[J].JMCB,2006,39(5):399-406.

[18] Chen YW,Chou HC,Lyu PC,et al.Mitochondrial proteomics analysis of tumorigenic and metastatic breast cancer markers[J].Funct Integr Genomics,2011,11(2): 225-239.

[19] Jiang YJ,Sun Q,Fang XS,et al.Comparative mitochondrial proteomic analysis of Rji cells exposed to adriamycin[J].Mol Med,2009,15(5-6): 173-182.

[20] Ciocca DR and SK Calderwood.Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications[J].Cell Stress Chaperones,2005,10(2):86-103.

[21] Szakács G,Annereau JP,Lababidi S,et al.Predicting drug sensitivity and resistance: profiling ABC transporter genes in cancer cells[J].Cancer Cell,2004,6(2): 129-137.

[22] Fusaro G,Wang S,Chellappan S.Differential regulation of Rb family proteins and prohibitin during camptothecin-induced apoptosis[J].Oncogene,2002,21(29):4539-4548.

[23] Dai Z,Yin J,He H,et al.Mitochondrial comparative proteomics of human ovarian cancer cells and their platinum-resistant sublines[J].Proteomics,2010,10(21):3789-3799.

[24] Jiang Y,Liu X,Fang X,et al.Proteomic analysis of mitochondria in Raji cells following exposure to radiation: implications for radiotherapy response[J].Protein Pept Lett, 2009, 16(11):1350-1359.