MicroRNA-21与实体肿瘤关系的研究进展

李先承，李秀男，宋希双

(大连医科大学 附属第一医院 泌尿外科，辽宁 大连 116011)

1 MicroRNA-21概述

MicroRNA(miRNA)是一类长度为17～25 nt的单链非编码RNA，平均长度22 nt，在植物和动物中广泛存在，具有很广泛的调控作用，是高等植物、动物生长发育的重要调节因子，进化上高度保守。miRNA能够通过与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者翻译抑制，在细胞增殖、分化、凋亡、基因调控及疾病的发生，尤其是肿瘤的发生发展中起着重要的作用。miR-21在人类多种肿瘤组织中高表达，通过作用于多种靶基因，参与细胞增殖、分化、凋亡，与肿瘤生长、侵袭、转移、耐药等密切相关。人们对miR-21的兴趣已在近年来急剧增加，本文对miR-21与实体肿瘤关系的研究进展进行综述。

2 MiRNA-21在多种实体瘤中的表达

MiR-21是第一个在不同的细胞株中作为细胞调节抑制基因被记录下来的。在随后的来自540个人类样本的大规模研究中发现，miR-21是在包括肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌的6个实体性肿瘤中唯一过表达的miRNA。有研究显示miR-21为一种致癌的miRNA，到目前为止在大多数癌症类型分析中均发现存在过度表达[1]。

2.1 MiR-21与前列腺癌

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一。有学者采集56例患者血清样本，其中包括20例原位前列腺癌患者，20例雄激素依赖性前列腺癌(ADPC)患者，10例接受多西他赛治疗的非雄激素依赖性前列腺癌(HRPC)患者以及6例良性前列腺增生患者。采用RT-PCR技术测定其血清中miR-21含量。结果显示ADPC和HRPC患者血清中miR-21呈高水平表达，且与血清中前列腺特异抗原PSA呈正相关。而血清中miR-21含量在良性前列腺增生，原位前列腺癌及ADPC患者中无明显差异。其中6名HRPC患者在接受多西他赛治疗后，血清内PSA水平下降50%以上并可得到部分缓解；而血清中miR-21增高的患者对多西他赛表现出明显的抗药性[2]。因此可以推测miR-21有可能成为前列腺癌向药物抵抗转化及化疗药物是否有效的一种标志物。相关的研究发现雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145和PC-3的反义寡核苷酸miR-21的失活，更容易导致细胞凋亡和抑制细胞转移及侵袭，而细胞增殖却没有受到影响。确定富含十四酰丙氨酸蛋白激酶C(MARCKS)的底物可能作为前列腺癌细胞的一个新靶点，在细胞的转移中起至关重要的作用。有数据表明，miR-21能促进前列腺癌细胞的凋亡抵抗、转移和侵袭，这些影响可能部分归因于其对PDCD4、TPM1、和MARCKS的调节[3]。因此，抑制miR-21的基因疗法或许对前列腺癌的治疗非常重要。有研究发现基因转录产物剪接位置的改变能激活雄激素受体[4]，此改变保留了肿瘤细胞对雄激素的依赖性，为进一步治疗前列腺癌增加了新的途径。有研究者通过miRNA矩阵选择，找出了包括miR-21在内的16个雄激素诱导的miRNA。同时另有研究发现用Northern blot方法对雄激素受体阳性的前列腺癌细胞系进行检测可以分析miRNA对雄激素的敏感性。用染色体免疫共沉淀的方法发现了miR-21的启动子与激素依赖的雄激素受体相关联[5]。Ribas等[6]发现了miR-21可增强前列腺癌细胞的增殖能力，在小鼠模型中，miRNA-21水平的提高加速了肿瘤细胞的形成和生长，诱导了去势后非雄激素依赖型前列腺癌出现，表明活化的雄激素受体可直接诱导miR-21的表达，最终导致前列腺癌细胞增殖和去势后的拮抗。这些研究结果为前列腺癌的治疗开辟了新的方向。

2.2 MiR-21与乳腺癌

Lorio等[7]最先在乳腺癌组织活检中发现mRNA的表达下降，同时有报道称miR-21作为肿瘤组织中始终上调的mRNA中的一员，进行性的增加肿瘤的分期，使用微阵列技术对正常组织和乳腺癌样本中mRNA表达的研究发现，与正常组相比，miR-21在所有乳腺癌样本中表达均上调；组织定位研究发现miR-21主要定位于管腔上皮细胞的胞液及正常乳腺组织的成纤维细胞中[8]。体外研究表明，乳腺癌细胞株MCF-7中使用序列特异性技术及被称为化学修饰的寡核苷酸的抗miR-21来敲掉miR-21的基因，可导致细胞的生长与miR-21的含量呈剂量依赖性关系。为了研究miR-21在体内肿瘤形成过程中的作用，将抗miR-21转染成功的MCF-7细胞注入雌性小鼠的乳腺中，结果显示被注射的细胞中miR-21表达的程度远远慢于对照组。这种肿瘤细胞增殖的减慢很有可能是由于选择性的下调miR-21的表达而导致的低效率增殖或者加速其凋亡造成的。有研究发现E2(雌二醇)对miR-21的下调作用可被雌激素拮抗剂阻断，从而可推断E2对miR-21的下调作用是由ERα介导的。在ERα依赖性反应过程中E2可使miR-21表达下调，而ERβ参与miR-21基础表达水平的调节，进一步研究发现，E2对miR-21的抑制作用与miR-21的靶点如PDCD4，PTEN和Bcl-2的上调密切相关。同时发现miR-21在男性和女性乳腺癌中的表达均高于正常乳腺组织，而且和乳腺癌进展、淋巴结转移以及生存时间相关。类似的，Smeets等[9]对96 例乳腺癌患者做了检测，发现是否有淋巴结转移的两组患者间的miRNAs表达存在差异。另外，Lehmann等[10]对9 例男性原发性乳腺癌患者肿瘤组织中的319 种 miRNAs 表达水平进行检查，结果发现miR-21、miR-519d、miR-183等5种miRNAs表达上调，其中miR-21上调最显著。后来有体外实验证实，抑制MCF-7细胞中miR-21的表达可通过下调抗凋亡蛋白Bcl-2这一机制来减少细胞的体内、外生长。此外，在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中，骨形态发生蛋白-6(BMP-6)可有效的抑制miR-21的表达；而且BMP-6作为治疗手段可有效逆转PDCD4的抑制作用。同时离体实验发现BMP-6可抑制miR-21介导的MDA-MB-231细胞的侵袭性[11]。Huang 等[12]研究发现MDA-MB-435 细胞可通过过表达HER2来上调miR-21水平进而增强其侵袭性，这可能与最近报道的miR-21靶基因PDCD4和maspin有关。有研究者对59例原发性乳腺癌、30例转移性乳腺癌以及29例健康女性血清中miR-10b、miR-34a、miR-141和miR-155的相对浓度进行检测，结果显示以上4种miRNAs在乳腺癌患者血清中增高，并与肿瘤分级相关。与淋巴结转移阴性患者比较，淋巴结转移阳性的患者循环let-7a水平低，而与ER阳性患者比较，ER阴性患者的循环miR-10b和miR-21水平高。进展期乳腺癌患者循环miR-21水平高于早期乳腺癌患者[13]。因此可以推测监测血清中miR-21的水平可能成为乳腺癌诊断、治疗及评估预后的一种新指标。

2.3 MiR-21与结肠癌

使用原位杂交技术(IHC)和miR-21特定的锁定核酸(LNA)probe的细胞和组织的定位方式表明miR-21在结直肠上皮细胞和结直肠腺癌成纤维细胞中高表达。在癌组织和细胞株中miR-21的表达水平与PDCD4蛋白表达水平呈负相关，这说明miR-21无论在体内还是体外都是PDCD4的负调节因子[14]。

5种miRNAs(miR-20、miR-21、miR-106a、miR-181b和miR-203)在结肠癌样本中过表达[15]。进一步分析表明，在癌症晚期阶段更高的miR-21表达水平或其本身的高水平表达都与糟糕的预后、较差的治疗反应以及更快的疾病复发相关。增加的miR-21表达与癌症分期、淋巴结和远处转移的发展呈正相关[16]。终末期结肠癌患者的肿瘤特异性miR-21的高表达与抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗反应不佳和更快速地疾病复发相关[15]。令人惊讶的是，在结肠癌细胞株中使用5-FU治疗后发现miR-21在肿瘤组织中的表达显著上调[17]。这个意想不到的效果可能是由于肿瘤细胞对5-FU的治疗产生了特异性防御机制。探索这种细胞防御机制可能为治疗结肠癌提供一种新途径。

2.4 MiR-21与肺癌

使用miRNA微阵列分析鉴定表达谱技术，测定成48对非小细胞肺癌与周围非癌组织成熟miR-21的含量，结果显示，miR-21的基因表达在肺癌组织中显著上调，同时抑制凋亡基因产物表达，miR-21可能是通过下调肿瘤抑制因子原肌球蛋白1(TPM1)，发挥癌基因功能[18]，这与肺癌发生、预后和总存活数密切相关有关。Yanaihara等[19]研究了非小细胞肺癌患者血清中相关的一些miRNA,发现有12种特异性miRNA的表达上调，其中包括miR-21。此外，分别使用功能丧失的miR-21等位基因和功能获得的miR-21等位基因的非小细胞肺癌小鼠进行实验，结果显示miR-21的过度表达增加了肿瘤的发生率，敲掉miR-21基因后可出现不完全的对抗肿瘤形成的效应。miR-21的这种作用可能是通过抑制Ras/MEK/EMK信号转导通路的负性调节元件如Spy1，Spy2，Btag2，PDCD4来实现的，且miR-21的靶基因为多种抑癌基因如Pten，RhoB，APaf1，Fas1g，并且抑制促凋亡基因的启动从而抑制细胞的正常凋亡[20]。

2.5 MiR-21与胃癌

有学者用探针实时定量PCR技术研究发现miR-21在人类胃癌组织和细胞株中显著地过表达。然而，miR-21在被幽门螺旋杆菌感染的胃黏膜内也明显地过表达，这提示胃癌中miR-21的过表达也许部分归因于幽门螺旋杆菌感染。更重要的是，miR-21的过表达增强了人胃癌细胞株AGS细胞的增殖能力和侵袭性；敲除miR-21基因后可导致细胞增殖的显著降低和细胞凋亡的显著上升，显著降低AGS细胞的侵袭和转移能力。幽门螺旋杆菌感染这个潜在的调节途径通过上调miR-21的表达，导致RECK基因表达的抑制，最终导致胃癌的发生[21]。因此推测RECK作为一种众所周知的胃癌肿瘤抑制因子，亦是miR-21的一种重要靶基因。使用芯片检测胃癌组织和正常胃组织中的miR-21表达的研究发现，miR-21在胃癌组织中的表达显著增加[22]。

2.6 MiR-21与胰腺癌

有学者为了评估miR-21在胰腺癌发生发展及治疗中的作用，分别在胰腺导管细胞癌的细胞株及人类癌组织中检测mRNA-21的表达，结果发现高表达miR-21的患者生存率明显低于低表达的患者。同时发现各种原代细胞株中miR-21表达的高低及对药物治疗的抵抗程度取决于该细胞株来源的组织。miR-21前体转染可显著降低抗肿瘤药物的药效并且显著减低胞苷所诱导的细胞凋亡，而基质金蛋白酶MMP-2/MMP-9及血管内皮生长因子的表达明显上调。添加肌醇磷脂3激酶和抗真菌类抗生素后可减低磷酸化AKt的水平，显著改善miR-21前体所诱导的对抗癌药物的抗药性[23]。另有研究发现使用反义核苷酸来抑制miR-21的表达可改变肿瘤细胞周期，促进肿瘤细胞的凋亡，并且可增强胞苷的抗癌药效[24]。影响肿瘤细胞侵袭及转移的因素如细胞凋亡程序的调整，蛋白激酶的磷酸化，基因表达的改变共同参与了miR-21在胞苷抗药性中的作用，这些发现为胰腺癌靶向联合治疗提供了新的方法。

3 MiR-21在肿瘤中的调控机制

MiR-21是从Hela细胞株中克隆获得的，在人类、大鼠、小鼠、鱼及蛙类中具有高度保守性。miR-21位于第17号染色体蛋白编码基因的第10个内含子(TMEM49)上。而TMEM49的功能至今尚不清楚。藤田等对miR-21的基因表达进行了大量的分析研究，结果显示miR-21的基因表达受其自身启动子而非与TMEM49相互重叠的基因启动子调控。另有研究发现在人类早幼粒细胞株及HL-10中，miR-21的转录是被AP-1与SWI/SNF复合物共轭激活的，而TMEM49的基因表达未发生改变。公认的miR-21的启动区域包含了3个AP-1结合位点和1个PU1的结合位点。使用计算机分析预测程序发现作为miR-21的一个靶基因的转录阻遏蛋白NFIB mRNA和miR-21启动子自身都包含了一个NFIB蛋白的保守集合位点。实验数据显示NFIB的降低与外源性miR-21的过表达相关，而miR-21抑制剂可使NFIB蛋白水平提高[25]。这些数据显示了miR-21的启动子，miR-21分子本身及miR-21靶基因都参与了miR-21基因表达调控的反馈。

目前己发现和证实的miR-21相关靶基因有几十种，其中绝大多数已被证实是直接调控的靶基因，如TPM1参与细胞骨架结构形成，Maspin参与细胞膜相互作用，PDCD4抑制细胞生长，PTEN抑制细胞迁移和增殖[26]，Nanog及Octamer4维持胚胎干细胞的自我更新和多向分化潜能，SPRY2影响细胞向外生长、分支和迁移[27]，RECK抑制肿瘤的侵袭和转移，STAT3调控转录和细胞运动性，APAF1调控细胞凋亡，HNRPK结合核酸，Tap63诱导细胞周期的停滞和凋亡[28]，SPRY1参与发育、调控信号转导，WNT1参与细胞迁移、细胞分化等，BTG2抑制细胞增殖，LRRFIP1参与负调控转录[29]；少数为间接调控的靶基因，他们虽然不能直接被miRNA调控，但可通过其他的介导因子间接的被调控，如Bcl-2抑制细胞凋亡[26]，TIMP3参与胞外信号引导细胞凋亡等。miR-21对靶基因的调控方式随着靶基因种类的不同而有所差异。miIR-21对部分靶基因可分别在mRNA和蛋白层两个层面发挥调控作用，同时各种miRNA与其靶基因绝非简单的一对一调控模式，而是一种错综复杂的网络调控模式。各种miRNA可协同作用，或相互拮抗，从整体上调节机体细胞的各种生命活动。

最新的研究数据表明miR-21表达具有高度复杂的调控机制，其中涉及独立的miR-21启动子及多种转录因子，类固醇激素及信号转导元件。对于miR-21基因表达调控的进一步分析需要基因鉴定调控网络及对miR-21基因表达调控的新的分子生物学机制的深入探讨。

4 MiR-21与肿瘤的诊断

肿瘤的早期诊断和早期治疗是决定肿瘤患者治愈率及预后的一个关键因素，临床中最常用的检查方法是影像学及血清标志物检验，而且目前常用的血清标志物几乎都是蛋白质，检测它们的传统方法需要繁重的实验室劳动，尚没有任何基于血清的检测广泛适用于疾病的诊断[30]。哺乳动物的血清血浆中存在miRNA，且血清中miRNA水平稳定性高、重复性好，并且在同种生物的个体中的表达几乎一致。循环核酸已被证明具有作为癌症的非侵入性诊断标志物的潜力。有学者通过比较弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者(n=60)和健康对照组(n=43)血清中miR-21等的水平来研究microRNAs是否也能作为诊断肿瘤的指标。结果提示实验组血清中的miR-21水平显著高于对照组。此外，miR-21的高表达与无复发生存率相关[31]。这是第1次对循环miRNAs的描述，并且说明了miR-21有作为弥漫性大B细胞瘤及可能更多癌症的非侵入性诊断性标志物。另外，通过miRNA表达谱甚至还可以鉴定肿瘤的组织学类型[32]。不同肿瘤具有不同的miRNA表达模式，通过miRNA表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计，因此，miRNA将成为肿瘤早期诊断及预后评估的新靶标，可作为多种疾病尤其是肿瘤诊断的非创伤性生物标志物。

有研究使用miRNA芯片技术对卵巢上皮癌患者血清中的miRNA进行了测定，发现卵巢癌患者和健康人血清中miRNAs的表达存在明显差异，其中miR-21、92、93、126、29a、155、127和99b等8个miRNA的表达差异具有统计学意义。另外，CA-125阴性的卵巢癌患者血清中，miR-21、92、93表达量显著增高，并且发现miR-21、miR-92、miR-93在患者CA-125升高以前出现[33]，提示外周血中miRNAs检测可用于卵巢癌的筛查诊断，其临床价值可能优于CA-125。

5 MiR-21与肿瘤的治疗和预后

随着对miRNAs在肿瘤发生发展中所起作用的深入认识，人们更多的关注从miRNA入手研究开发新型抗癌药物的新途径，改变肿瘤中miRNAs的表达量被视为一种新的治疗策略，主要包括引入抑癌基因性miRNAs、敲除或削减癌基因性miRNAs。miR-21作为目前唯一的在几乎所有肿瘤中表达上调的miRNA，其参与了肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及肿瘤的血管生成等多个环节，并且在体外已经证实与多个抗肿瘤药物的敏感性有关。Gumireddy等[34]发现偶氮苯可作为miR-21生物合成特定有效的抑制剂。这些特异性miRNA抑制剂不仅是研究miRNA功能的独特工具，而且是增强患者对现有化疗或癌症治疗药物应答的试剂。有研究发现通过抑制miR-21的表达能够增加胆管癌细胞对吉西他滨的敏感性。进一步的研究显示miR-21可能通过调节PTEN依赖的PI3K信号通路从而影响吉西他滨相关的细胞凋亡情况。miR-21过表达还降低肿瘤细胞对VM226、拓扑替康等抗肿瘤药物的敏感性[29-30]。同时发现偶氮苯可作为miR-21生物合成特定有效的抑制剂。这些特异性miRNA抑制剂不仅是研究miRNA功能的独特工具，而且是增强患者对现有化疗或癌症药物应答的试剂。目前认为，miR-21调控肿瘤细胞的多种药物敏感性的机制主要与miR-21参与调控细胞周期，抑制细胞凋亡有关。

最近的研究结果显示高水平的miR-21表达与预后差密切相关[36]，如Schetter等[15]在结肠癌的研究中发现miR-21可作为一个独立有效的预后指标，高表达者预后差；对接受辅助化疗的Ⅲ期患者的观察中发现miR-21高水平者预后要比低水平者差，提示miR-21可能是一个预测化疗疗效的指标。但同时另有报道指出高水平的miR-21表达与预后无相关性或相反的结论[37]，如在胃癌的相关研究中发现miR-21虽呈现高表达，但并不影响预后。另有报道指出miR-21与胃癌的无复发时期和总生存率相关。同时有学者对49例胃癌患者的肿瘤组织检测中发现miR-21的表达与肿块大小和浸润深度相关[38]。Dillhoff等[39]在胰腺癌研究中发现miR-21表达与肿瘤大小、分化、淋巴结转移及T分期无关，但是在淋巴结阴性的亚组分析中，miR-21高表达则提示预后较差。为深入探讨miR-21与肿瘤患者预后的相关性，有学者以“miR-21与肿瘤”和“miRNA与肿瘤预后”为关键词收集了1996-2010年的17项研究数据进行系统分析，结果显示：在总体存活率的分析中发现各种肿瘤组织miR-21高水平表达的合并危险比为1.69(P<0.001)，提示miR-21过表达降低患者存活率。

6 存在的问题与展望

MiR-21作为一类具有重要调控作用的内源性小RNA分子广泛参与了机体多种生物学过程的调控。由于miR-21几乎参与了肿瘤发生发展的每一步过程，所以miR-21在肿瘤的诊断、预后、对化疗药物的疗效预测以及治疗的新靶点方面均有很好的应用前景。然而人们对于miRNA的了解还十分有限，开发基于miRNA的诊疗手段还需要更多、更详尽的研究。针对miRNA的作用机制，开发肿瘤特异性的诊断和治疗药物是研究的最终方向。此外，miRNA与临床相关的研究领域起步时间尚短，且缺乏大量样本及多中心的研究数据。相信不久的将来，随着越来越多的可靠数据的产生，miRNA作为肿瘤诊断、治疗、疗效预测及预后判断的重要分子标志将可能会得到极大程度的认可和推广。

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