Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π检测在非小细胞肺癌预后中的价值

李海峰，竺王玉，黄燕燕，周吉航，刘晓光

Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π检测在非小细胞肺癌预后中的价值

李海峰1，竺王玉2，黄燕燕2，周吉航2，刘晓光2

目的：探讨凝溶胶蛋白（Gelsolin）、P糖蛋白（P-gp）、拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）、谷胱苷肽转移酶（GST-π）在预测非小细胞肺癌（NSCLC）临床病理特征、癌细胞转移和患者预后中的价值。方法：采用S-P免疫组化法检测126例NSCLC患者癌组织标本及其癌旁组织标本Gelsolin蛋白、P-gp、TopoⅡ、GST-π表达情况。结果：Gelsolin蛋白在NSCLC患者中的阳性表达率为31.7%，P-gp为38.1%，TopoⅡ为52.4%，GST-π为85.7%。Kaplan-Meier生存分析显示，Gelsolin蛋白及P-gp阳性患者生存率较Gelsolin蛋白阴性患者为低（P＜0.05），Cox风险比例模型显示淋巴结转移、Gelsolin蛋白及P-gp阳性可显著增加NSCLC患者的死亡风险（P＜0.05）。结论：Gelsolin蛋白与P-gp表达增加与NSCLC淋巴结转移及肿瘤进展相关，联合检测Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π，可作为临床早期发现NSCLC转移及预测预后的指标。

非小细胞肺癌;凝溶胶蛋白;P糖蛋白;转移

肺癌是全球死亡率最高的癌症，其原因之一便是肺癌易发生隐匿转移及化疗药物耐药。凝溶胶蛋白（Gelsolin）为一种肌动蛋白结合蛋白，在细胞运动中发挥重要作用，与肿瘤的浸润转移也有一定关系。P糖蛋白（P-gp）、拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）、谷胱苷肽转移酶（GST-π）是肿瘤多药耐药的基础，被认为是多种肿瘤化疗失败的原因，与肿瘤预后差有关。为寻找非小细胞肺癌（non-small cell lung cacer，NSCLC）转移预后的标志物，评价NSCLC手术后的预后状况，我们应用S-P免疫组化方法，分析2006年6月—2009年6月在浙江省舟山医院住院并手术的NSCLC患者Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π表达与肺癌组织临床分期、组织学类型、肿瘤淋巴结转移等临床病理特征及患者生存率间的关系，以根据其表达评估预后并选择合适的治疗方案，探讨基因检测在肿瘤个体治疗中的应用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取肺癌根治术后的NSCLC患者126例，取距癌灶＞6 cm的癌旁组织作对照组。126例中男80例，平均年龄66.7岁；女46例，平均年龄60.0岁。术前均未经放疗、化疗或其他方法治疗，也未患有其他癌症，术后生存期＞1个月。TNM分期根据2006年国际抗癌联盟NCCN指南进行分期，Ⅰ＋Ⅱ期96例，Ⅲ＋Ⅳ期30例。组织学分类依2004年WHO肺癌分类标准，鳞癌50例，腺癌50例，细支气管肺泡癌26例。淋巴结转移38例，远处转移1例。

1.2 试剂 鼠抗人Gelsolin单克隆抗体（ABS017，SC57509）购自Santa Cruz公司，多克隆抗兔、鼠二抗购自Invitrogen公司（REF 87-8973），鼠抗人P-gp（ZM-0347）、TopoⅡ（ZM-0245）、GST-π（ZM-0110）单克隆抗体及免疫组化试剂（SP9002），DAB显色液（ZLI9032）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。1.3 检测方法 采用S-P免疫组化法。石蜡切片（切片厚度为5μm）常规脱蜡，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，一抗孵育前均用0.01 M枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）煮沸微波抗原修复；加入10%的BSA（牛血清白蛋白）37℃孵育，加Gelsolin（1∶100稀释）或P-gp、TopoⅡ、GST-π（即用型）鼠抗人单克隆抗体，4℃过夜；加HRP（辣根过氧化物酶）标记多克隆羊抗兔、鼠二抗37℃孵育，DAB染色，苏木素复染。用PBS代替一抗做空白对照，已知阳性片做阳性对照。

1.4 判断标准 Gelsolin蛋白表达于巨噬细胞、成纤维细胞、正常肺上皮细胞及肺癌细胞胞浆，P-gP表达于肺癌细胞胞膜或（和）胞质，TopoⅡα表达于肺癌细胞胞核，GST-π表达于胞核或胞质。按染色强度计分：0分为无色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；在高倍镜（×40）下取10个不同视野，各计数100个细胞，按阳性细胞所占的百分比计分：阴性为0分，阳性细胞＜10%为0分，10%～39%为1分，40%～69%为2分，＞70%为3分。染色强度与阳性细胞百分比的积分乘积，0分为阴性（一）；1～3分为弱阳性；≥4分为阳性（+）。

1.5 统计学分析 计数资料用率表示，不同组间比较用χ2检验；相关性分析采用非参数Spearman等级相关分析，生存率的比较采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-rank检验，预后因素采用Cox分析，SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织中Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π表达 Gelsolin呈弥漫性或局灶性不均匀分布，阳性表达率为31.7%（40/126），P-gp为38.1%（48/126），TopoII为52.4%（66/126），GST-π为85.7%（108/126），见图1～图4。癌旁组织中Gelsolin蛋白均为弱阳性表达，P-gp阳性率为7.1%（10/126），TopoⅡα阴性为9.5%（12/126），GST-π为12.7%（16/126）。均较癌组织为低（P＜0.05）。

图1 Gelsolin蛋白在NSCLC中阳性表达，免疫组化SP法，表达于细胞浆×400

图2 P-gp在NSCLC中阳性表达，免疫组化SP法，表达于细胞浆及细胞膜×400

图3 TopoⅡ在NSCLC中阳性表达，免疫组化SP法，表达于细胞核×400

图4 GST-π在NSCLC中阳性表达，免疫组化SP法，表达于细胞核及细胞浆 ×400

2.2 NSCLC组织中Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π表达与临床病理学特征的关系 女性P-gp表达高于男性，GST-π男性表达高于女性；鳞癌、腺癌患者Gelsolin蛋白表达高于细支气管肺胞癌者；低分化癌者Gelsolin、TopoⅡ、GST-π表达高于中高分化癌者；NSCLC伴淋巴结转移者Gelsolin、P-gp表达高于未转移者；Ⅲ+IV期Gelsolin、P-gp表达高于I+Ⅱ期（P＜0.05）。Gelsolin、P-gp、TopoⅡα、GST-π表达与年龄、肿瘤大小、吸烟状况、是否累及脏层胸膜及远处转移均无关（P＞0.05），详见表1。

2.3 Gelsolin、P-gp、TopoⅡα、GST-π协同表达与淋巴结转移的关系 有淋巴结转移的NSCLC患者，Gelsolin、P-gp、TopoⅡα、GST-π3种或4种协同表达率分别为36.8%和26.3%，均高于NSCLC淋巴结未转移者（P＜0.05），详见表2。仅有的1例远处转移患者Gelsolin、P-gp、TopoⅡα、GST-π亦均呈阳性表达。

2.4 NSCLC组织中 Gelsolin、P-gp、TopoⅡα、GST-π表达与术后生存期的关系 Kaplan-Meier生存分析显示，Gelsolin表达阴性组患者，自肺癌根治术后平均生存时间为37.6个月；Gelsolin表达阳性组患者，平均生存期为30.3个月。Log-rank检验P＝0.0113。P-gp表达阴性组平均生存时间为38.7个月，阳性组为30.2个月，Log-rank检验P＝0.0278，差异有统计学意义（图5～图6）。TopoⅡ表达阴性组平均生存时间为35.3个月，阳性组为35.1个月，GST-π表达阴性组平均生存时间为37.0个月，阳性组为35.1个月，差异均无显著意义。非参数Spearman等级相关分析显示，TopoⅡ与GST-π呈明显相关，r＝0.249，P＝0.042，其他则无明显相关性（P＜0.05）。

2.5 NSCLC患者术后死亡的Cox分析 除患者年龄外，其他变量赋值情况：性别（男=1，女=2），吸烟情况（否=0，是=1），组织学类型（鳞癌=1，腺癌=2，细支气管肺泡癌=3），分化程度（低分化=1，中分化=2，高分化=3），肿瘤大小（T1=1，T2=2，T3=3，T4=4），累及脏层胸膜（否=0，是=1），淋巴结转移（无=0，有= 1），临床分期（Ⅰ=1，Ⅱ=2，Ⅲ=3，Ⅳ=4），Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π表达（阴性＝0，阳性＝1）。单因素Cox分析结果显示淋巴结转移、Gelsolin蛋白及P-gp阳性表达情况为患者预后的危险因素（P＜0.05），见表3。

表1 Gelsolin、P-gpTopoⅡ、GST-π表达与NSCLC临床病理特征的关系

表2 Gelsolin、P-gp、TopoⅡα、GST-π协同表达与淋巴结转移的关系

图5 Gelsolin蛋白表达阳性（positive）和阴性（negative）组NSCLC患者术后生存时间（月）的Kap lan-Meier生存曲线（P＝0.0113）

图 6 P-gp表达阳性（positive）和阴性（negative）组NSCLC患者术后生存时间（月）的Kap lan-Meier生存曲线（P＝0.0278）

表3 NSCLC患者术后死亡的Cox分析

3 讨论

肺癌位居全球新增癌症之首，年死亡人数超过100万，术后5年生存率极低，这与其易发生广泛转移及化疗药物耐药有极大的关系。Gelsolin最初发现于兔巨噬细胞，为重要的肌动蛋白结合蛋白，与细胞运动密切相关。现有研究表明，Gelsolin在多种肿瘤细胞中表达降低，敲除Gelsolin基因能够促使人乳腺上皮细胞转变为间叶细胞，导致人乳腺癌的发生[1]，抑制卵巢癌细胞、膀胱癌细胞和黑色素瘤细胞集落生成[2]，在一定程度上发挥着抑癌基因的作用。另有研究却表明，Gelsolin蛋白表达与低生存率及预后差有关，Gelsolin与细胞运动有关，高Gelsolin可增强肿瘤的侵袭转移能力[3]。下调胰腺癌细胞系[4]及人类乳腺癌上皮细胞MCF10A中的Gelsolin后[5]，均发现细胞的运动能力和侵袭能力相应下调，说明Gelsolin具有增加肿瘤细胞的运动能力，与肿瘤的浸润转移有一定关系[6]。本研究结果显示，Gelsolin在正常肺上皮细胞呈弱阳性表达，在肺癌细胞的阳性表达率为31.7%，NSCLC晚期、分化程度低、有淋巴结转移者Gelsolin蛋白阳性表达率较高。Kaplan-Meier生存分析显示，Gelsolin表达阳性者平均生存时间明显低于阴性者，Cox预后分析亦表明Gelsolin阳性患者预后较差，与多项研究结果一致[5,7-12]。说明Gelsolin可能为肺细胞异质性的一个参数，可增强肺癌细胞的运动，使肺癌细胞的浸润迁移能力增强，易引起肺癌的转移，预后较差。

肺癌患者预后不仅与肺癌转移有关，与癌症多药耐药亦呈显著相关关系[11]。P-gp能将药物泵出细胞外或者将药物泵入膜性细胞器内，并滞留其中，使胞质内药物浓度降低，降低了抗癌药物浓度，造成癌细胞耐药性。结果显示，肺癌晚期、有淋巴结转移患者P-gp阳性表达率较高。Kaplan-Meier生存分析显示，P-gp表达阳性者平均生存时间明显低于阴性者。Cox预后分析亦表明，P-gp阳性患者预后较差。这与肺癌多药耐药产生，机体对P-gp转运的化疗药物产生耐药性导致疗效不显著有关[12]。GST-π阳性率增高常出现在许多难治疗的肿瘤中，并可作为肿瘤启动的标志[13]。TopoⅡ是真核细胞生存所必不可少的核酶，直接参与DNA修复、转录及分离。本结果显示，NSCLC中GST-π和TopoⅡ阳性率分别为85.7%和52.4%，低分化者GST-π和TopoⅡ表达增高有关，并且两者呈正相关，提示GST-π和TopoⅡ可能在肺癌发生发展中及对化疗药物耐药中起协同作用。本研究亦发现，在淋巴结转移的NSCLC患者中，Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π3种或4种共表达率远高于未发生淋巴结转移者。研究中仅有的1例远处转移患者，4种基因均呈阳性表达。说明肺癌转移是多基因多途径协同作用的结果，发生转移者对化疗药物的敏感性亦呈现一定程度的降低，导致预后不佳。

Gelsolin和P-gp在NSCLC进展和淋巴结转移中发挥重要作用，NSCLC患者Gelsolin和P-gp阳性者低生存率较低，联合检测Gelsolin、P-gp、TopoⅡ、GST-π可前瞻性地作为临床早期发现NSCLC转移及预测预后的指标。

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（收稿：2011-07-06 修回：2011-11-20）

（责任编辑 何培坤）

Prognostic Value of Gelsolin,P-gp,TopoII and GST-πExpression in Non-small Cell Lung Can⁃cer Patients

LI Hai-feng,ZHU Wang-yu,HUANG Yan-yan,et al.ZhouShan Hospital,Zhejiang Prov⁃ince,(316004),China

Non-small cell lung cacer,Gelsolin,P-glucose protein,metastasis

R734.2

A

1007-6948(2012)01-0009-06

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.01.003

舟山市科技局项目（091042）;舟山市卫生局项目（2008B002）

1.浙江省舟山医院呼吸科（舟山 316004）

2.浙江省舟山医院中科院免疫基因组学联合实验室（舟山316004）

竺王玉，Email：zhuwangyu24@gmail.com

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of Gelsolin,P-gp,TopoⅡand GST-πin non-small cell lung cancer(NSCLC)and to determine the relationship between their expression and clinicopathological features of patients with non-small cell lung cacer. Methods SP immunohistochemical assay was used to detect the expression of Gelsolin,P-gp,TopoⅡand GST-π in 126 NSCLC and matched paracancerous tissue. Results The positive rate of Gelsolin,P-gp,TopoⅡand GST-πin lung carcinoma was 31.7%,38.1%,52.4%and 85.7% respectively.Kaplan-Meier survival analysis showed that Gelsolin or P-gp positive patients had shorter survival time than that with negative patients(P＜0.05);Cox regression analysis revealed that lymph node metastasis or Gelsolin,P-gp positive expression were the noticeable affective factors on the death of the NSCLC patients after surgery. Conclusion Gelsolin and P-gp play an important role in the development in NSCLC and correlate with metastasis and shorter survival time in patients with NSCLC.Gelsolin and P-gp detections can be used as early biomarkers in metastasis and prognosis for NSCLC patients.