苯溴马隆对罗格列酮在小鼠体内药动学的影响

阮 冲，李新春，夏 爽（广西医科大学，南宁 530021）

罗格列酮（Rosiglitazone，Rog）为第2代噻唑烷二酮类（TZDs）衍生物，是选择性的过氧化物酶增殖体γ受体（PPAR-γ）激动药，近年来广泛应用于2型糖尿病的治疗。其作用机制主要是通过增加肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取，抑制肝糖元的异生，增强胰岛素的敏感性，从而发挥降糖的作用[1]。苯溴马隆（Benzbromarone，Beb）属苯并呋喃衍生物，是一种新型的尿酸排泄促进剂，该药不仅能抑制肾小管对尿酸的重吸收，还可抑制嘌呤氧化酶，对降低尿酸具有双重功效，临床上主要用于高尿酸血症和痛风的治疗[2]。高尿酸血症（包括痛风）与糖尿病、高血压、高血脂以及胰岛素抵抗相关联，大约有14.1%的2型糖尿病患者合并有高尿酸血症[3]，因此在糖尿病的治疗过程中可能会联合使用尿酸排泄剂（如Beb）。Beb是一种强效的细胞色素P450（CYP）2C9抑制剂[4]，能够抑制多种CYP2C9的底物如甲苯磺丁脲、吲哚美辛等药物的代谢；Rog在肝脏内主要经CYP2C8代谢，CYP2C9也参与其体内的代谢过程[5]，因此在Beb与Rog联合使用时，可能会对Rog的代谢产生影响。

近来，美国食品药品管理局（FDA）提出药物预警:Rog可能会增加心血管事件的风险[6]，因而探讨联合用药情况下该药物在体内的代谢过程显得尤为必要。目前尚未有Rog与Beb联合使用时Rog药动学研究的报道。本研究拟建立高效液相色谱-荧光（HPLC-FLU）法，考察Beb对Rog在小鼠体内药动学的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括LC-10ATvp输液泵、RF-10Axl荧光检测器、5301PC荧光分光光度计（日本Shimadzu公司）；超纯水发生器（美国Millipore公司）；精密移液器（法国Gilson公司）。

1.2 试药

Rog对照品（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号:20080518，纯度:99.5%）；Beb原料药（广东东阳光药业有限公司，批号:080902，纯度:98.8%）；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 动物

昆明种小白鼠110只，♀♂不拘，体重（20±1.5）g，购自广西医科大学实验动物中心，许可证号:SCXK（桂）2003-0003。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈-四氢呋喃-10 mmol·L－1KH2PO4（含0.2%三乙胺，H3PO4调pH至5.5）＝45∶10∶45，使用前经0.45 μm微孔滤膜过滤和超声脱气，流速:1 mL·min－1；荧光检测波长:λex＝247 nm、λem＝370 nm；柱温:30 ℃；进样量:20 μL。

2.2 系统适用性试验

取空白血浆、Rog对照品溶液、空白血浆+Rog对照品溶液、血浆样品处理后，按“2.1”项色谱条件进样测定。结果显示，Rog峰形良好，保留时间约为6.8 min；理论板数按Rog计大于6 000；血浆中的内源性物质及代谢物不干扰Rog的出峰。取浓度为1 μg·mL－1的Rog对照品溶液重复进样6次，峰面积的RSD为1.6%。色谱见图1。

2.3 对照品溶液的制备

取Rog对照品25 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加甲醇适量使溶解，定容到刻度，摇匀，得浓度为1 mg·mL－1的贮备液，置于4℃冰箱中保存。精密吸取贮备液适量，分别置于7个量瓶中，加甲醇稀释，使浓度分别为0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg·mL－1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 Rog荧光光谱考察

用甲醇制备浓度为1 μg·mL－1的Rog对照品溶液，以甲醇为空白，在荧光分光光度计上扫描，其最大激发波长和发射波长分别为247 nm和370 nm。

2.5 血浆样品的处理

精密吸取血浆0.2 mL，置于5 mL离心管中，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液0.1 mL，涡旋混匀10 s，加入乙醚-二氯甲烷（2∶1，V/V）混合液2 mL，涡旋提取3 min，于3 500 r·min－1离心5 min，转移上清液1.0 mL至另一尖底离心管中，置于40℃水浴中，通N2流挥干，残渣用100 μL流动相复溶，涡旋混合30 s，8 000 r·min－1离心3 min，取20 μL进样。

2.6 标准曲线与检测限考察

精密吸取Rog对照品系列溶液各20 μL，分置于7个5 mL的离心管中，N2流挥干溶剂，加入空白血浆0.2 mL，混匀，得浓度分别为20、50、100、200、500、1 000、2 000 ng·mL－1的含药血浆样品，按“2.5”项下操作，记录药物色谱峰面积，以峰面积（A）对血药浓度（c）作加权回归计算。得回归方程:A＝1.584×103c－236.5（r＝0.999 7）。结果表明，Rog检测浓度的线性范围为20～2 000 ng·mL－1；按S/N＞3∶1计，本方法的最低检出限为5 ng·mL－1。

2.7 回收率试验

按“2.6”项下方法用空白血浆制备Rog浓度分别为50、200、1 000 ng·mL－1的低、中、高浓度血浆样品，每种浓度重复5个样本，按“2.5”项下操作。以血浆样品中药物峰面积与相对应的Rog的峰面积之比，计算绝对回收率；用标准曲线计算得到的浓度值除以理论值，得相对回收率，结果见表1。

表1 回收率与精密度试验结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision of tes（t±s，n＝5）

表1 回收率与精密度试验结果（±s，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision of tes（t±s，n＝5）

浓度/ng·mL－1 50 200 1 000绝对回收率/%84.0±6.8 88.4±7.5 89.8±6.3相对回收率/%104.5±11.9 99.6±7.4 96.9±8.8 RSD/%日内11.3 7.4 9.0日间8.6 5.4 10

2.8 精密度试验

取“2.7”项下方法制备处理后的低、中、高浓度血浆样品，分别在同日内测定，每个浓度平行分析5次，考察日内精密度；另3种浓度每日各测定1次，连续测定5 d，考察日间精密度。结果见表1。

2.9 给药方案

取小鼠随机分为单用组（Rog 0.2 mg·kg－1）和 联用组（Rog 0.2 mg·kg－1+Beb 5 mg·kg－1）组，每组55只，按人临床常用剂量换算灌胃给予相应药物，给药前12 h禁食，但全程不限饮水。将Rog和Beb分别用0.5%的羧甲基纤维素钠（CMCNa）溶液制成混悬液后进行灌胃。给药后分别于0.17、0.33、0.75、1.5、2.0、2.5、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h随机处死5只小鼠抽取静脉血，合并同一时间点血样，置于肝素化的抗凝试管中，3 000 r·min－1离心5 min，分取血浆，置于－20 ℃冰箱中保存。

2.10 血药浓度的测定与药动学参数计算

用所建立的HPLC-FLU法测定“2.9”项下采得血浆中Rog的浓度。另外，用空白血浆制备浓度分别为75、250、1 500 ng·mL－1的含药血浆，作为质控（QC）样品，按“2.5”项下操作，每种浓度重复6次，记录色谱，采用3p97软件进行拟合。结果表明，Rog在小鼠体内过程符合一级吸收的一室模型（权重系数为1），药动学参数结果见表2。

3 讨论

目前关于Rog定量分析的方法有HPLC-紫外检测法及高效毛细管电泳法[7]、液质联用法[8]等。由于Rog的血药浓度低，利用紫外检测器时，其灵敏度达不到分析的要求；高效毛细管电泳法尽管具有极高的分离效能，但方法的精密度较差，制约了其在生物分析中的广泛使用。

Wang等[8]采用去蛋白方法处理血样，但这种方法不能使药物有效地富集，因此极大地降低了分析的灵敏度。考虑到Rog的血药浓度低，笔者前期分别尝试了乙醚、二氯甲烷和乙酸乙酯等有机溶剂进行提取，结果发现乙醚的提取效率低（小于70%），而后2种溶剂对Rog均有很高的绝对回收率。但由于单独采用二氯甲烷提取时，有机相位于下层，使得转移挥干的操作不便；而选用乙酸乙酯提取时，血浆中内源性物质对药物出峰存在着一定的干扰，遂尝试用乙醚-二氯甲烷混合溶剂提取，可有效地避免内源性物质的干扰。

本研究结果显示，联用Beb时，Rog的cmax和AUC0～24h均显著升高（P＜0.05），提示Beb在小鼠体内可增强Rog的吸收，增加其生物利用度。这种效应是否会增加Rog所致的心血管风险还有待进一步的研究。

[1]Inqlis AM，Miller AK，Culkin KT，et al.Lack of effect of rosiglitazone on the pharmacokinetics of oral contraceptives in healthy female volunteers[J].J Clin Pharmacol，2001，41（6）:683.

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[3]曹雪霞，王 立.国产苯溴马隆治疗2型糖尿病合并高尿酸血症的疗效与安全性[J].中国新药杂志，2006，15（4）:301.

[4]Locuson CW 2nd，Wahlstrom JL，Rock DA，et al.A new class of CYP2C9 inhibitors:probing 2C9 specificity with high affinity benzbromarone derivatives[J].Drug MeTab Dispos，2003，31（7）:967.

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[6]雷嘉川，宋金春.2008－2010年门诊药房口服抗糖尿病药应用分析[J].中国医院用药评价与分析，2011，11（9）:786.

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[8]Wang M，Miksa IR.Multi-component plasma quantitation of anti-hyperglycemic pharmaceutical compounds using liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，856（1-2）:318.