微乳液相色谱法同时测定三合平脂胶囊中谷维素与黄连素的含量Δ

石勇，张守尧，张忠义，贺帅（南方医科大学珠江医院药剂科，广州510282）

黄连素与谷维素均为传统经典老药，临床应用广泛，近年来药理学研究和临床应用[1，2]表明，较大剂量的黄连素和谷维素均具有降低血脂的作用，且谷维素可以促进黄连素的体内吸收[3]，在笔者的前期研究中发现两者合用可产生协同降血脂的作用。目前关于谷维素的含量测定方法2010年版《中国药典》尚未收录，在卫生部部颁药品标准[4]中采用紫外分光光度（UV）法；而黄连素的含量测定在2010年版《中国药典》中采用高效液相色谱（HPLC）法；文献中采用HPLC法[5～8]和UV法[9～11]测定黄连素、谷维素含量的报道也较多，笔者对这些方法进行了逐一筛选，发现这些方法均无法排除同一种制剂中二者的相互干扰，实现同一制剂中2组分的同时测定，也未见如何同时分离测定黄连素与谷维素的文献报道。新兴的微乳液相色谱（Microemulsion liquid chromatography，MELC）是指以微乳为流动相的HPLC法，具有独特的分离效能，分离效率高，国内、外已有较多文献报道[12～14]。笔者采用MELC法实现了黄连素与谷维素的同时分离测定，且准确度高、重复性好，可用于制剂的质量控制分析，为后期黄连素与谷维素复方制剂的开发提供了研究基础，弥补了同时分离测定黄连素与谷维素的研究空白。

1 仪器与试药

Agilengt 1100 HPLC仪（美国安捷伦公司）；RD-200电子分析天平（德国赛多利斯公司）；超声仪（江苏昆山市超声仪器公司）。

谷维素对照品（日本东京化成贩壳株式会社，批号:YNPCO000172，纯度:99%）；盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号:110713-200911，纯度:86.8%，本试验中黄连素含量以盐酸小檗碱计算）；乙腈为色谱纯，十二烷基硫酸钠（SDS）、三乙胺（TEA）及其他试剂均为分析纯；三合平脂胶囊（珠江医院药剂科提供，批号:091225、100124、100210，主要组分为谷维素与黄连素，制备时将黄连素与谷维素按一定比例（暂时不宜公开）物理混合后直接装胶囊，不含其他辅料）。

2 方法与结果

2.1 测定波长的选择

分别精密称定谷维素和盐酸小檗碱对照品适量，以乙腈作为溶剂制备成26.4 mg·L－1的谷维素对照品溶液和9.45 mg·L－1的盐酸小檗碱对照品溶液，在200～500 nm波长范围内分别扫描，结果见图1。

图1 紫外光谱图Fig 1 UV spectrum

比较谷维素和黄连素的紫外光谱图可发现在230 nm波长处谷维素与黄连素吸收峰比较接近；另外在230 nm波长处可排除溶剂的干扰，基线稳定性好，因此确定测定波长为230 nm。

2.2 微乳流动相的制备

取33 g SDS，加入约800 mL的0.5%TEA水溶液中，搅拌至完全溶解，再加入100 mL正丁醇、10 mL正辛烷和30 mL乙酸乙酯，最后加入0.5%TEA水溶液稀释至1 000 mL，超声15 min至形成澄明溶液，即得微乳流动相，磷酸调节pH＝3，0.45 μm滤膜过滤备用。

2.3 色谱条件

色谱柱采用Agilent XBD C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；采用“2.2”项下的微乳流动相，流速为1 mL·min－1；二极管阵列检测器（DAD），检测波长为230 nm；柱温为30℃。

2.4 溶液制备

盐酸小檗碱对照品溶液:精密称定盐酸小檗碱对照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

谷维素对照品溶液:精密称定谷维素对照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

供试品溶液:精密称定三合平脂胶囊内容物粉末20 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀备用。

空白溶液:取乙腈稀释后作为空白溶液。

2.5 专属性考察

取盐酸小檗碱对照品溶液、谷维素对照品溶液、空白溶液和供试品溶液各20 μL，进样测定，记录色谱图。结果表明，盐酸小檗碱的峰与相邻的杂质峰，以及谷维素主峰与相邻的杂质峰的分离度均符合要求，详见图2所示。

2.6 线性考察

取盐酸小檗碱对照品10 mg、谷维素对照品10 mg置于50 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀备用。分别精密量取上述混合对照液1、2、5、10、15 mL置于25 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。按“2.3”项下色谱条件，对5份对照品溶液各进样20 μL，每个浓度重复进样3次，测定并记录峰面积。以浓度（c）与峰面积（A）进行线性回归，得盐酸小檗碱与谷维素线性方程分别为A＝6.742 8c－2.378 7（r＝0.999 8）、A＝22.615 2c+16.006 4（r＝0.999 1），结果表明二者检测浓度线性范围均为8～200 mg·L－1。

图2 微乳液相色谱图Fig 2 MELC chromatograms

2.7 加样回收率试验

分别精密量取2 mL已知浓度的样品溶液3份于50 mL量瓶中，分别加入混合对照液2、5、10 mL，加流动相稀释至刻度，摇匀，取20 μL进样测定（n＝3），按“2.3”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.8 精密度试验

精密量取混合对照液5 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，每次进样20 μL，反复进样9次，计算峰面积RSD值。结果黄连素RSD＝1.4%，谷维素RSD＝2.5%，表明本法精密度较好。

2.9 稳定性试验

精密量取混合对照液5 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，同日内0、2、4、6、8 h进样1次；连续3 d每天进样1次，计算峰面积的RSD值。结果表明，黄连素在乙腈中稳定性好，RSD＝1.6%；谷维素在乙腈中稳定性较差，仅在8 h（1 d）内保持稳定，RSD＝3.4%。

2.10 方法耐用性考察

当色谱柱由Agilent Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）更换为Agilent Hypersil ODS C18（250 mm×4.0 mm，5 μm）时，盐酸小檗碱和谷维素的色谱峰变宽、保留时间延长，但盐酸小檗碱峰与相邻的杂质峰，以及谷维素峰与相邻的杂质峰的分离度均大于1.5；柱温在25～35℃变化以及流速在0.8～1.2 mL·min－1变化时，该方法仍然适用。

2.11 样品含量测定

取批号为091225、100124、100210的样品，分别按“2.4”项下供试品溶液制备方法制备，按照“2.3”项下色谱条件测定，每批样品测定3次，取其平均值，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 讨论

谷维素在部颁标准UV法含量测定中所用溶剂为正庚烷，另有文献报道[15～17]采用氯仿、乙醇、异丙醇等作为溶剂，而本试验中笔者选用乙腈作为溶剂是因为黄连素不溶于正庚烷，而黄连素与谷维素在乙腈中均有较大的溶解度，并且以乙腈作为溶剂符合2010年版《中国药典》附录紫外-可见分光光度法中对溶剂的要求，因而选用乙腈作为溶剂。

2010年版《中国药典》中黄连素含量测定采用HPLC法，其色谱条件为磷酸盐缓冲液（0.05 mol·L－1磷酸二氢钾和0.05 mol·L－1庚烷磺酸钠溶液（1∶1），含0.2%三乙胺，并调pH至3.0）-乙腈（60∶40），但采用该方法同时测定黄连素与谷维素时，谷维素在120 min内仍未出峰；部颁标准中，谷维素的含量测定方法为UV法，由于谷维素与黄连素在紫外吸收范围内均有吸收，无法实现制剂中2组分的含量测定。本试验用微乳液相色谱法测定黄连素与谷维素复方制剂的含量，能够有效地排除制剂中2组分的相互干扰，省时省力，准确性高，可用于制剂中黄连素与谷维素的含量测定和质量控制。

谷维素是环木菠萝醇类与阿魏酸组成的阿魏酸酯类混合物，本试验将其作为一个整体的研究对象，进行含量测定的研究，能够有效地实现制剂中谷维素含量的控制，与张连成等[5]报道的方法思路一致。

试验中为消除黄连素与谷维素拖尾的现象，曾尝试在流动相中添加0.2%～1%（V/V）的三乙胺，结果0.5%的三乙胺能使得峰形变窄、拖尾减轻，再加入3%乙酸乙酯后，峰形更为理想。

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