三维培养与角膜基质组织工程学研究进展▲

李 霞综述 谭少健审校

(广西医科大学第一附属医院眼科，南宁市 530027)

二维平面是最常见的体外细胞培养方式，其支持细胞生长的底物是由聚苯乙烯或玻璃制成，所提供的培养平面是扁平的，这是绝大多数研究中细胞的生长与黏附的形式。但由于二维培养并不能真正显现组织中的细胞外基质，很多在二维培养中的生理反应，如受体表达、转录表达、细胞移行及凋亡已被证实和实际器官或组织所发生的情况很不一样。而且细胞从分裂、增殖、迁徙和凋亡，是一连串被精确调控的事件，有赖于其内部固有的空间立体及时间上的组织原则。二维培养被认为是过于简单且忽略了很多精确再现细胞及组织生理的重要参数，包括机械信号、细胞与其基质的通讯、细胞间通讯及不同类型的细胞间通讯，在很多二维培养的实验中，均没有考虑到不同类型的细胞的相互作用，二维共培养离准确再现组织内细胞的功能还是有很大距离［1］。2000年以后，越来越多的研究组将细胞的空间组织考虑入细胞的培养环境中［2～4］，即进行体外细胞的三维培养。这些研究的普遍共同目标是在二维单层培养细胞及动物实验之间建立连接的桥梁。目前，三维培养主要应用于组织工程学研究。本文对三维培养现有的途径、技术及三维培养在角膜组织工程学中应用现状进行综述。

1 三维培养概况

1.1 三维培养模型 培养模式被分为:整个动物和器官移植培养(包括胚胎)、细胞球、微载体培养及组织工程模型等［5］。并不是所有的三维培养都需要培养支架，然而在过去的10年中，支架的应用得到了大幅度的提高。整个动物和器官移植培养主要用于对于组织特异性有绝对需要的研究中。这些模型使细胞位于其天然的环境中，例如黑腹果蝇、斑马鱼及小鼠胚胎的应用。培养的条件，例如pH值、温度、氧含量必须要严格控制。器官培养的优点包括保持了组织的体系结构，更重要的是在组织中呈现分化的细胞。这样的培养模式，技术上要求在时间上维持标本的完整性和可以深入样本深部采集图像。细胞球体是简单的三维培养模式，可以用于多种细胞类型及形式。他们可从单培养和共培养(如悬滴培养、旋转培养、凹板培养等)方式构建而成。细胞球体不需要支架，可以用光学显微镜、荧光显微镜及共聚焦显微镜观察。细胞球常常被用在固体肿瘤的生长转移的研究中，他同时也被应用于较多的治疗研究中，例如高通量筛查等。

1.2 生物学材料支架 支架的出现是为了提高三维培养模型的体积及其复杂性。除了空间的调控外，细胞的聚集还需要特别注意细胞的营养及气体供应、交换。当细胞聚集厚度达到1～2 mm时引起大分子物质的转运缺乏，而此时所发生的主要营养物质及代谢产物交换是有限的，因此细胞死亡会增多［6］。支架应高度疏松，多孔，同时兼具形状细胞黏附部位及气体、营养成分及代谢物的流动。不同类型的细胞被植入基质中，具有不同的特性及形状。临床工作的功能性植入物需要的是一个暂时性的可生物降解的支架，该支架在植入以后可以被身体重塑并由天然组织取代而重建原有功能。在这种情况下，支架必须提供细胞的生长和分化，同时支架大小必须与其空缺部分具有物理性匹配。此外，支架必须以无毒性及无免疫原性的代谢物的形式进行讲解。三维培养的另一个作用是作为体外培养模型来进一步了解组织生理学或作为药物及化妆品筛查的评价系统［7］。这样的情况下，三维系统重要的是准确的复现自然组织的结构，该结构含有相应的细胞，同时这些细胞得到并处于相应分化阶段。对于这种情况，更需要获得的是应用这些模型获悉细胞的功能和反应，而这些模型的支架的绝对大小及其需要的水解和降解就不显得那么重要了。

用以搭建支架的疏松多孔材料有金属、玻璃、聚合物及陶瓷。聚合物由于在构建支架过程中得到联合应用，其可控的化学特性及结构特性而受到普遍应用。聚合物可以分为合成类和天然衍生类。合成类材料包括聚羟基己酸(Poly Glycolic Acid，PGA)及聚乳酸(poly lactic acid，PLA)，而天然衍生聚合物包括壳聚糖(Chitosan)及胶原。对于所有的生物材料支架的一个普遍要求，就是要再现一个细胞外基质环境以支持细胞在体外环境中的生长。

生物材料表面的化学特性对于细胞的黏附及活细胞的播散是非常重要的。这样的化学特性并不是生物化学材料所必需，而更多的是由生长培养基或者细胞本身提供。表面化学特性主要由电荷及极性来决定，也就是一般术语中所说的控制可溶性蛋白在表面的吸引及弥散吸收。表面电荷的广泛程度和被吸收蛋白质的比率之间存在一定关系。这和细胞黏附于生物材料存在关系。细胞是通过被吸收的蛋白质层来相互作用的，而不是直接和生物材料表面作用。1.3 三维结构的生物反应器 营养供给是设计包括临床用途及体外模型的三维培养系统时所需要考虑的问题。早期简单的三维培养模型基于静态的方法。然而，生物反应器的设计及应用越来越被和三维培养系统及组织工程学整合起来［8］。生物反应器可以精确及可重复地控制细胞培养的很多因素。这些因素包括温度、pH、培养液流动速率、氧气、营养供应及代谢产物的移除。此外，在复杂三维系统得到研发过程中，如何控制种子细胞植入支架亦得到同时研究。这方面主要是应用外界因素促进种子细胞分化及成熟。目前很多先进的系统具有在细胞生长过程中维持和监控环境的能力。有数种生物反应器设计，但是总体来说，可以分为以下几种:旋转壁式(rotating wall vessels，RWV)、直接灌注系统(direct perfusion system)、中空纤维(hollow fibres)、悬浮培养瓶(spinner flasks)、机械动力系统(mechanical force systems)等。

1.4 三维培养模型的细胞来源 三维培养及组织工程所需的细胞来源通常来自于宿主或者供体。由于无论是从细胞的来源或部位来看，细胞的种类繁多，但是对于组织工程而言，通常分为干细胞、自体细胞、同种细胞及异种细胞等。对于体外三维培养模型，种子细胞可以是动物来源的原代细胞、细胞系以及以上所有类型细胞经遗传改良后所有的变种细胞。许多研究者喜欢采用自体细胞应用于临床植入，因为可以避免免疫排斥反应。组织工程软骨作为典型例子已经被广泛报道。然而，自体细胞并不是总是可用的，因为在体外却没有活力或者无增殖能力。因此，有时候只能应用同种细胞，然而，这样的情况还是会存在免疫不相容性。异种细胞在临床上可以应用于在组织内提供化学物质。一个较好的异种移植例子是利用胰岛产生胰岛素。而这种情况需要一个半透膜将这些异种胰岛细胞包绕。选用原代细胞的常见的问题是他们获取困难，或者不能产生足够的细胞量来应用于临床。因此，应用前体细胞和多能干细胞具有广阔的前景。对于前体细胞的应用而言，目前已经取得了令人瞩目的进步:分离、扩增、鉴定、定向分化等。造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等来源的组织有:肺、肝、视网膜、胰腺、心血管系统、脑、脊柱、脂肪组织及骨髓。无论来自何组织，任何干细胞应用的最大挑战在于如何使干细胞在直接细胞分化过程中更高度精准地向预期表型分化。

2 角膜三维培养与组织工程学研究进展

2.1 角膜组织工程学在角膜病治疗中的意义 角膜病是仅次于白内障的第二大致盲性眼病。目前，世界上有超过1 000万的双眼角膜盲患者，而且每年新增角膜盲病例150～200万［9］。角膜移植是目前治疗角膜盲的唯一有效治疗方法。但角膜移植存在角膜供体严重缺乏、术后发生免疫排斥反应等问题［10］。组织工程角膜(Bioengineered Cornea)的构建旨在用其修复病损的角膜组织，改善患眼视觉，从而解决角膜供体材料缺乏这一关键问题。

角膜由上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层组成。角膜组织中含有角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞三种细胞，而前弹力层和后弹力层不含细胞成分。角膜组织工程学研究构建的组织包括上皮、基质和内皮以及三维角膜。组织工程化角膜上皮应用于临床已有报道［11，12］。目前，应用温度敏感培养技术已经在体外构建出组织工程化角膜内皮细胞片，且已证明这样的内皮细胞片在细胞形态、细胞间连接及单层细胞结构方面和天然的角膜内皮细胞层相似［13，14］。无论是在进行角膜上皮层或角膜内皮层重建的过程中，都必须为之提供理想的载体。而角膜基质是所有载体中的最佳选择。由于角膜基质占整个角膜厚度的90%，基质层受损之后由瘢痕组织修复，使角膜失去透明性。因此，构建组织工程角膜基质不仅为组织工程角膜上皮或内皮细胞层提供载体，同时也为修复受损的基质提供手段。

2.2 角膜基质组织工程国内外研究概况及研究趋势 以种子细胞构建组织工程角膜基质，目前有依赖细胞本身进行自主装备途径(Cell-Based Approaches)和依靠支架培养途径(Scaffold-Based Approaches)。前者主要是依靠培养液中的成分刺激种子细胞分泌胶原及其他细胞外基质［15～17］，而种子细胞表达角膜组织特异性的标志物。该方法最大的缺陷是需要较长的时间来培养可供移植用的角膜基质材料。Guo等［16］利用角膜纤维细胞自主装备细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)，产生多层细胞而厚度达36 μm的结构需要4周的培养。

在应用种子细胞和生物学支架构建角膜基质的研究领域中，研究者们对种子细胞和生物支架都进行了广泛的探索。

2.2.1 种子细胞 组织工程角膜基质中大多数是利用角膜基质细胞(keratocyte)作为种子细胞。目前，国内外学者应用的基质细胞大多来源于动物［18～20］，制备的组织工程角膜基质可以用作角膜损伤修复的体外模型，如以临床应用为目的则需解决异种移植中免疫排斥这一关键性问题。此外，基质细胞作为种子细胞存在的问题还有:①如何维持基质细胞在三维培养中的细胞表型?体外培养会影响基质细胞的表型。基质细胞在含有血清的培养基中转化为成纤维细胞，基质细胞标志消失［21，22］。而成纤维细胞目前被认为是促进角膜伤口愈合，导致角膜瘢痕化的原因。基质细胞只有在静止状态下才可以维持其细胞表型。然而静止状态下即意味着基质细胞无法大量扩增，提示着在合成细胞与支架复合体的初始阶段就需要大量的基质细胞。②如何获得大量的人基质细胞用以构建组织工程角膜基质?人角膜基质干细胞(Human Cornea Stroma Stem Cells)的发现使这一问题的解决成为可能［17，23，24］。人角膜基质干细胞构建组织工程角膜基质仍存在同种异体移植发生免疫排斥的可能，而角膜基质干细胞的培养亦受到供体角膜匮乏的局限。

由于角膜组织细胞来源有限，应用干细胞和成体细胞进行角膜组织工程学的研究成为目前的研究热点。应用胚胎干细胞存在伦理学问题和大量扩增可能致瘤的安全性问题，使得成体干细胞受到研究者的青睐［25］。我国上海交通大学第九人民医院研究组以新生兔皮肤成纤维细胞为种子细胞，接种于聚羟基乙酸，体外培养一周后移植入成年兔角膜基质，发现转移的细胞可以存活并表达角膜基质特有的基因。这一发现提示着非眼部细胞将有可能成为组织工程角膜基质的种子细胞［26］。

2.2.2 支架材料 制备良好的组织工程角膜支架一直是该领域的研究重点。理想的支架材料应具备良好的生物相容性、具有一定的韧性和人体角膜相似的物理化学性能、降解速率与植入种子细胞所形成组织器官的速率匹配，在支架完成为角膜组织提供模板功能后，可被完全降解吸收或成为与新生组织相互融合的组成部分等特点［27］。常见的支架材料有胶原、壳聚糖、纤维蛋白、聚羟基乙酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)和脱细胞组织基质(acellular corneal matrix)。目前国内外学者应用这些支架材料在研制组织工程角膜基质上已经取得很大的进展［28～30］，但是各种支架材料均存在一定局限性。胶原纤维是角膜基质的主要组成成分，胶原蛋白占角膜干重的75%。胶原组织相容性好，含有某些特异的氨基酸序列，利于种子细胞黏附生长。其不足之处在于稳定性较差，机械强度小，降解快。可以通过物理或者化学方法对其进行交联，提高其机械强度和抗降解能力。壳聚糖的缺陷是材料与宿主的整合性差。PGA降解过快，PLA降解产物会对细胞活性产生不利影响，引起无菌性炎症反应。脱细胞角膜基质具有天然角膜的板层纤维结构、韧性及厚度，由于去除了角膜内大量的抗原，其免疫原性大为降低，一般采用猪角膜基质制备［25］。脱细胞角膜基质的安全性、组织的透明性等仍需要长期的评估。

3 问题与展望

寻找理想的种子细胞和理想的支架材料一直是角膜基质组织工程学领域的“瓶颈问题”。随着分子生物学技术的发展完善，将分子生物学、生物化学等学科与组织工程学相结合是组织工程角膜的研究趋势。2009年，角膜组织工程学界著名的Griffith教授针对现有研究的局限性，对角膜组织工程学界提出:拓展组织工程角膜的种子细胞来源，改进支架材料，构建出含有和人体角膜一样的生物化学、形态、生理甚至遗传物质的理想组织工程角膜，是目前该研究领域的研究目标［9］。这一目标在既往寻找种子细胞和改进支架材料等研究热点的基础上进一步提出了重视对组织工程角膜细胞生物学行为、分子机制、微环境调控以及长期转归等问题进行深入研究的要求。相信在不久的将来，这一目标将得以实现。

［1］ Haycock JW.3D cell culture:methods and protocols(methods in molecular biology)［M］.New York:Humana Press，2011:1－13.

［2］ Abbott A.Cell culture:Biology＇s new dimension.Nature，2003，(424):870－872.

［3］ Langer R，Tirrell DA.Designing materials for biology and medicine［J］.Nature，2004，428(6982):487－492.

［4］ Lee J，Cuddihy MJ，Kotov NA.Three-dimensional cell culture matrices:State of the art［J］.Tissue Eng Part B Rev，2008，14(1):61－86.

［5］ Pampaloni F，Reynaud EG，Stelzer EHK.The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue［J］.Nature Rev Mol Cell Biol，2007，(8):839－845.

［6］ Griffith LG，Swartz MA.Capturing complex 3D tissue physiology in vitro［J］.Nature Rev Mol Cell Biol，2006，(7):211－224.

［7］ Canton I，Sarwar U，Kemp EH，et al.Real-time detection of stress in 3D tissue-engineered constructs using NF-kB activation in transiently transfected human dermal fibroblasts［J］.Tissue Eng，2007，(13): 1013－1024.

［8］ Martin I，Wendt D，Heberer M.The role of bioreactors in tissue engineering［J］.Trends Biotechnol，2004，22(1):80－86.

［9］ McLaughlin CR，Tsai RJ，Latorre MA，et al.Bioengineered corneas for transplantation and in vitro toxicology［J］.Front Biosci，2009，14: 3326－3337.

［10］Shah A，Brugnano J，Sun S，et al.The development of a tissue-engineered cornea:biomaterials and culture methods.Pediatr Res，2008，63(5):535－544.

［11］Yang J，Yamato M，Nishida K，et al.Corneal epithelial stem cell delivery using cell sheet engineering:not lost in transplantation［J］.J Drug Target，2006，14(7):471－482.

［12］ Tsai RJ，Li LM，Chen JK.Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells［J］.N Engl J Med，2000，343(2):86－93.

［13］Lai JY，Chen KH，Hsu WM，et al.Bioengineered human corneal endothelium for transplantation［J］.Arch Ophthalmol，2006，124(10): 1441－1448.

［14］Sumide T，Nishida K，Yamato M，et al.Functional human corneal endothelial cell sheets harvested from temperature-responsive culture surface［J］.FASEB J，2006，20(2):392－394.

［15］ Carrier P，Deschambeault A，Talbot M，et al.Characterization of wound reepithelialization using a new human tissue-engineered cornea wound healing model［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2008，49 (4):1376－1385.

［16］Guo X，Hutcheon AE，Melotti SA，et al.Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(9):4050－4060.

［17］Du Y，Sundarraj N，Funderburgh ML，et al.Secretion and organization of cornea-like tissue in vitro by stem cells from human corneal stroma［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48(11):5038－5045.

［18］Torbet J，Malbouyres M，Builles N，et al.Orthogonal scaffold of magnetically aligned collagen lamellae for corneal stroma reconstruction.Biomaterials，2007，28(29):4268－4276.

［19］ Xu YG，Xu YS，Huang C，et al.Development of a rabbit corneal equivalent using an acellular corneal matrix of a porcine substrate［J］.Mol Vis，2008，14:2180－2189.

［20］李晓霞，陈建苏，李沁华，等.模拟微重力条件下兔角膜基质细胞在符合材料上的三维培养［J］.眼科研究，2008，26(4):241－244.

［21］Funderburgh ML，Mann MM，Funderburgh JL.Keratocyte phenotype is enhanced in the absence of attachment to the substratum［J］.Mol Vis，2008，9(14):308－317.

［22］Funderburgh JL，Funderburgh ML，Mann MM，et al.Proteoglycan expression during transforming growth factor beta-induced keratocytemyofibroblast transdifferentiation［J］.J Biol Chem，2001，276(47): 44173－44178.

［23］Funderburgh ML，Du Y，Mann MM，et al.PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes［J］.FASEB J，2005，19(10): 1371－1373.

［24］Du Y，Funderburgh ML，Mann MM，et al.Multipotent stem cells in human corneal stroma［J］.Stem Cells，2005，23(9):1266－1275.

［25］范先群.组织工程角膜的研究现状和存在的问题［J］.上海交通大学学报(医学版)，2008，28(6):619－21.

［26］ Zhang YQ，Zhang WJ，Liu W，et al.Tissue engineering of corneal stroma layer with dermal fibroblasts:phenotypic and functional switch of differentiated cells in cornea［J］.Tissue Engineering.Part A，2008，14(2):295－303.

［27］刘晓霞，陈建苏.组织工程角膜支架材料［J］.广东医学，2005，26(9):1293－5.

［28］Crabb RA，Chau EP，Evans MC，et al.Biomechanical and microstructural characteristics of a collagen film-based corneal stroma equivalent［J］.Tissue Eng，2006，12(6):1565－75.

［29］McLaughlin CR，Fagerholm P，Muzakare L，et al.Regeneration of corneal cells and nerves in an implanted collagen corneal substitute［J］.Cornea，2008，27(5):580－589.

［30］林旭明，赵 靖，史伟云.壳聚糖构建的组织工程角膜基质的实验研究［J］.眼科研究，2008，26(6):409－12.