STAT1和ICAM－1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义*

张 洁， 陈俊杰， 陈成水， 王梦怡

(温州医学院附属第一医院呼吸内科，浙江温州325000)

肺癌的发病率和死亡率均居世界恶性肿瘤的首位，严重危害着人类的健康。在我国，肺癌已超过死因的20%，肺癌每年大约有40万例患者死亡［1］。目前在临床上，虽然有不少肿瘤标志物已经在应用，像鳞状细胞癌抗原、癌胚抗原、细胞角蛋白19和神经元特异性烯醇化酶，但是肺癌的发病率及死亡率每年仍呈持续增长。研究表明，肿瘤的发生是多基因、多因素导致细胞增殖和死亡异常的结果［2］。目前，有研究发现信号转导与转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)和细胞间黏附分子 －1(intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1)与恶性肿瘤的发生关系密切，但它们与非小细胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)关系的报道较少。本研究应用 real－time PCR和Western blotting方法对NSCLC组织中的STAT1和ICAM－1进行检测，拟探讨它们在肺癌组织中的表达情况与肿瘤病理、不同分期、有无转移的相互关系，了解其在肺癌发展和转移中的作用，为肺癌的及早诊断和治疗提供线索和依据。

材料和方法

1 材料

1.1 研究对象 选取2010年6月至2011年6月期间于温州医学院附属第一医院行外科手术切除的肺癌患者，术后皆得到病理证实的NSCLC标本40例;取离肿瘤组织5 cm以上的肺组织作为正常对照40例。男性29例，女性11例，年龄36～79岁，平均年龄56.2岁，病理图片见图1。依据WHO肺癌的分类方法进行组织学分类，其中鳞癌13例，腺癌27例(其中包括2例肺泡细胞癌)，依照肿瘤分级标准(依据组织结构、异型性、核分裂象等)分为高－中分化组及低分化组，高－中分化24例，低分化16例。按国际抗癌联盟(UICC)2009年肺癌分期分为I期、II期、III期和IV期，由于本研究病例数有限，将I期和II期归为临床早期，III期和IV期归为临床晚期，早期肺癌29例，晚期肺癌11例。出现淋巴结转移的有12例，无转移的有28例。

1.2 试剂 Real－time PCR试剂盒(Fermentas); SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX(Bio－Rad);TRIzol裂解液(Invitrogen);BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo);预染蛋白质marker和膜封闭液(Thermo)。哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒(Fermentas);PVDF膜(联科生物公司，中国);鼠抗人STAT1单抗和兔抗人ICAM－1单抗(BD);鼠抗人β－actin单抗、HRP标记的山羊抗鼠Ⅱ抗和HRP标记的山羊抗兔Ⅱ抗(联科生物公司);ECL发光液(Thermo)。

Figure 1.Pathological images of NSCLC and adjacent normal lung tissues(HE staining，×40).A:adenocarcinoma;B:lung tissue adjacent to the adenocarcinoma; C:squamous cell carcinoma;D:lung tissue adjacent to the squamous cell carcinoma.图1 NSCLC及癌旁肺组织的病理图片

2 方法

2.1 Real－time PCR方法检测STAT1和ICAM－1的表达 手术切除后采集的新鲜标本在液氮下保存。用TRIzol裂解液提取总RNA，然后逆转录成cDNA，进行实时定量PCR。各引物序列如下:STAT1上游引物5’－TGC ATC ATG GGC TTC ATC AGC－3’，下游引物5’－GAA GTC AGG TTC GCC TCC GTT C－3’;ICAM－1上游引物5’－GGC TGG AGC TGT TTG AGA AC－3’，下游引物5’－ACfT GTG GGG TTC AAC CTC TG－3’;GAPDH上游引物5’－CCA GCC GAG CCA CAT CGC TC－3’，下游引物5’－ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT－3’。所有数值采用2－ΔΔCt法进行相对定量分析。

2.2 Western blotting检测 将组织标本剪碎，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂及磷酸化酶抑制剂，提取组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。每组取30 μg蛋白样品经凝胶电泳分离后将蛋白转印至PVDF膜，含5%脱脂奶粉(BD)的缓冲液室温封闭2 h后，Ⅰ抗(1∶1 000鼠抗人STAT1单克隆抗体，1∶1 000的β－actin单克隆抗体)4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，Ⅱ抗(1∶8 000山羊抗鼠IgG－HRP多克隆抗体)室温孵育2 h，再用TBST缓冲液洗膜，ECL化学发光显色，X光显影。重复上述过程，检测ICAM－1蛋白，Ⅰ抗浓度为1∶1 000，Ⅱ抗浓度为1∶8 000，β－actin同上。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计学处理，配对资料采用配对样本t检验，例数不同时，采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 Real－time PCR检测STAT1和ICAM－1在组织中的表达

STAT1和ICAM－1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于非恶性肺组织(癌旁肺组织)，且两者差异显著(P＜0.05)，见表1。

表1 STAT1和ICAM－1在组织中的表达比较Table 1 .The expression of STAT1 and ICAM－1 in lung tissues detected by real－time PCR(±s.n=40)

表1 STAT1和ICAM－1在组织中的表达比较Table 1 .The expression of STAT1 and ICAM－1 in lung tissues detected by real－time PCR(±s.n=40)

*P＜0.05 vs normal lung tissue.

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2 Real－time PCR检测STAT1表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

STAT1在低分化组织中的表达高于高－中分化组织，且两者差异显著(P＜0.05);在临床分期中，肺癌早期组高于肺癌晚期组，差异显著(P＜0.05);而在不同病理类型、有无转移、不同性别、不同年龄组别中，表达无显著差异(P＞0.05)，见表2。

3 Real－time PCR检测ICAM－1表达与非小细胞肺癌临床病理特征的关系

ICAM－1的表达在腺癌中比在鳞癌中强，且两者差异显著(P＜0.05);在临床分期中，肺癌晚期组高于肺癌早期组，显著差异(P＜0.05);表达在有远处转移组高于无远处转移组，且差异显著(P＜0.05)。而在不同性别、年龄组别中，表达无显著差异(P＞0.05)。但在低分化组织中与在高－中分化组织中的表达相比有过度表达的趋势，但无显著差异(P＞0.05)，见表2。

4 Western blotting检测STAT1和ICAM－1在组织中的表达

STAT1及ICAM－1在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于非恶性肺组织(癌旁肺组织)中的表达，且两者差异显著(P＜0.05)，见图2、3。

讨论

肿瘤的侵袭和转移是十分复杂的生物学现象，是肿瘤细胞与宿主间一系列复杂、多步骤、相互作用的结果［3］。STAT1和ICAM－1分别参与其中。

表2 STAT1和ICAM－1表达与NSCLC临床病理特征的关系Table 2 .The relationship between the expression of STAT1 and ICAM－1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC detected by real－time PCR(±s)

表2 STAT1和ICAM－1表达与NSCLC临床病理特征的关系Table 2 .The relationship between the expression of STAT1 and ICAM－1 and the clinicopathological characteristics of NSCLC detected by real－time PCR(±s)

*P＜0.05 vs squamous cell carcinoma;△P＜0.05 vs well differentiated;#P＜0.05 vs late(stage);▲P＜0.05 vs without (lymph node metastasis).

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STAT是一种DNA结合蛋白，STAT蛋白最重要的功能是参与机体免疫应答和调控细胞增殖与转化，STATs家族共有 7个成员［4］，其中 STAT1是STAT家族最早被发现的成员，分子量为91 kD，其基因位于小鼠1号染色体上面，相当于人的2号染色体的q12至q33区［5］。STAT1是一类新型细胞内信号转导和基因表达调控因子家族，与炎症、肿瘤、免疫性疾病的关系日益受到人们的重视［6］。STAT1具有与P53相近的功能:肿瘤的监视和抑制作用，可被IFN－α、IFN－γ、IL－6、IL－2、表皮生长因子、IL－10等细胞因子激活［7］。研究显示在多种恶性肿瘤组织和细胞中有STAT表达异常或活性明显增强，这提示STAT表达异常与恶性肿瘤发生发展有密切关系［8］。在人类多发性骨髓瘤、肺癌和乳腺癌等肿瘤中，均可检测到STAT1高表达。STAT1是肿瘤抑制子［9］，并主导干扰素信号转导过程;除为先天性免疫所必需外，也充当生长抑制子和凋亡促动子［10－11］。有临床研究表明，在肺癌的早期(I～II期)，STAT1表达较高，随着肺癌的临床病理进展(III期)，STAT1的表达下降。提示STAT1在早期肺癌患者中的免疫监视和抗肿瘤的作用较强［12］。本研究发现，非小细胞肺癌组织中的STAT1表达明显高于癌旁肺组织，并且在肺癌早期组高于肺癌晚期组，这提示，STAT1在肺癌组织中持续激活，发挥着肿瘤抑制因子的抗肿瘤作用。而且STAT1在肺癌早期发挥了一定的免疫监视作用，随着肺癌疾病进展免疫监视功能亦下降，可能是癌细胞通过某种抑制作用，抑制STAT1的表达，从而逃避机体的免疫监视。在本研究中，不同分化程度的肺癌STAT1表达有差异，与分化程度呈负相关趋势，低分化癌高表达，高分化癌低表达，提示STAT1与肺癌的恶性程度有相关性。

Figure 2.STAT1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.Lane 1，3:normal lung tissue;Lane 2，4:NSCLC.±s.n=40.*P＜0.05 vs normal lung tissue.图2 STAT1在肺组织中的表达

Figure 3.ICAM－1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.Lane 1，3:normal lung tissue; Lane 2，4:NSCLC.±s.n=40.*P＜0.05 vs normal lung tissue.图3 ICAM－1在肺组织中的表达

ICAM－1又称 CD54，属于免疫球蛋白超家族［13］，是淋巴细胞功能相关抗原 －1(lymphocyte function－associated antigen－1，LFA－1)的配体。研究表明，ICAM－1在多种类型的肿瘤组织中存在异常表达，一定程度上反映了肿瘤的侵袭转移能力［14］。目前报道较多的有黑色素瘤、肾癌、肝癌、卵巢癌等［15］。ICAM－1分子在肿瘤侵袭、转移及抗肿瘤免疫中的作用成为近几年的研究热点。ICAM－1分布在淋巴管及血管内皮细胞、纤维母细胞、肾上皮细胞等，是参与介导细胞间黏附识别的重要黏附分子［16］，它可与淋巴细胞表面的受体LFA结合，从而使淋巴细胞与内皮细胞稳定黏附。ICAM－1过度活化可促使过多可溶性ICAM－1(sICAM－1)进入血液，竞争性抑制血液循环中ICAM－1/LFA－1依赖的MHC－1类抗原对游离癌细胞的免疫识别作用，从而使癌细胞逃离免疫监视，更容易发生侵袭和转移［17］。本实验结果显示，肺癌组织ICAM－1明显高于非恶性肺组织。提示肺癌组织表达ICAM－1是机体抗肿瘤免疫功能提高的表现，ICAM－1通过与相应LFA－1、Mac－1结合使更多的免疫效应细胞聚集，发挥机体免疫系统的抗肿瘤作用，使机体的免疫监视能力增强［18］。在临床分期中，肺癌晚期组高于肺癌早期组，ICAM－1的表达上调可能与肺癌细胞的TNM分期有密切关系，说明随着疾病的加重，ICAM－1水平也伴随升高，促进细胞的恶性增殖，导致癌细胞侵袭转移，这可作为评估非小细胞肺癌是否进展的指标之一。腺癌的ICAM－1表达高于鳞癌，这与腺癌比鳞癌易于侵袭和转移的临床特点基本符合。同时有淋巴结转移的肺癌病人组织中ICAM－1表达增强，预示了ICAM－1与淋巴结转移有密切关系，可能是ICAM－1与LFA－1结合后，随着淋巴细胞的转移进入血液循环，在毛细血管或淋巴窦内滞留和着床，形成转移灶，有利于淋巴细胞黏附血管内皮细胞并向邻近组织侵袭。

本实验发现，STAT1和ICAM－1在肺癌组织中的表达与癌细胞的侵袭和转移密切相关。这提示检测STAT1和ICAM－1水平有助于判断肺癌患者的病情，期待能为临床上肺癌转移及预后判断和基因治疗提供实验室依据。而随着肺癌的临床病理进展(III～IV期)，STAT1的表达下降，相应的免疫监视功能亦下降，具体机制还有待探讨和明确。本次研究发现STAT1在肺癌早期中的表达高于晚期，而ICAM－1则刚好相反，STAT1通过何种途径怎样具体调节ICAM－1的表达，从而在不同的肺癌分期及病理类型中有差异，还有待研究。

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