化学修饰小干扰RNA研究进展

孙 青 傅广波 庄海军 王云炎 牛晓兵

南京医科大学附属淮安第一医院泌尿外科 淮安 223300

1 RNAi的历史背景

RNAi是生物体内的一种通过双链RNA(dsRNA)来抵抗病毒入侵和抑制转座子活动的自然机制，是生物学中的普遍现象［1］。RNAi现象早在1993年就有报道:将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，却事与愿违成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象为“共抑制”。直到1998年，Fire等［2］将正义RNA与反义RNA以及一段与基因序列同源的反义RNA和模板RNA复性退火后的双链分别注入到线虫体内，发现经过纯化的单链RNA在基因抑制方面的效应非常微弱，而经过纯化的dsRNA却能高效特异性阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级，他们将观察到的现象称为RNAi，由此揭开了研究siRNA特异性基因沉默机制的序幕。

2 RNAi的作用机制

在RNAi作用的起始阶段中外源性或内源性的双链RNA被Dicer酶切割为19～2lbp的小分子干扰RNA片段(small interfering RNA，siRNA);随后siRNA与核酶复合物结合后形成RNA诱导沉默复合体(RNA－induced silencing complex，RISC)。RISC特异性地与细胞内同源mRNA结合后，随即被内切酶切割，于是mRNA片段由于缺少聚腺苷酸尾或稳定的帽子结构而很快被降解，最终导致基因的沉默［3－8］(见图1、2)。从发现至今，在短短几年中，对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展，RNAi以其快速、简便、特异、高效等优势被广泛应用于基因功能研究，肿瘤治疗和抗病毒感染等领域。应用siRNA技术特异地封闭在细胞癌变过程中发挥重要作用的原癌基因、突变失活的抑癌基因、凋亡相关基因等，使基因表达降低，癌细胞生长受抑制，从而达到治疗肿瘤的目的。RNAi已显示其具有许多传统技术无法比拟的优势:(1)高特异性:RNAi只对同源mRNA有作用，而对其他mRNA的表达则无影响;(2)高效性:siRNA能在低于反义核酸几个数量级的浓度下，显著抑制基因表达甚至完全沉默，从而产生缺失突变体表型，比基因敲除更快更简单;(3)高稳定性:以3'端悬垂TT碱基的dsRNA尤为稳定;(4)高穿透性:RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。这些优点使siRNA成为肿瘤研究中的热点。RNAi与其他疗法如放化疗和免疫治疗等结合，可为肿瘤的治疗开辟一条新的途径，特别是广泛应用于多种肿瘤如肺癌、肾癌、前列腺癌及病毒感染性疾病诊断和治疗的临床前研究［6］。

图1 siRNA形成机制示意图

图2 RNAi作用机制示意图

3 RNA干扰的化学修饰

当前，RNAi类核酸药物根据修饰成分的不同可分为以下三种:裸siRNA(即未经修饰的siRNA)、载体连接的siRNA及化学修饰的siRNA。裸siRNA由于分子稳定性差，易被核酶降解，体内分布广泛，细胞摄取困难，存在靶外基因沉默现象和免疫刺激等，所以应用范围不广。而载体连接的siRNA采用腺病毒、质粒、逆转录病毒等载体，则具有一些弊端［9］:如插入的外源性基因不能转导非分裂细胞、可能与内源性基因发生重组、病毒载体本身可引起机体的免疫反应并可能通过插入突变激活细胞的癌基因，导致恶性肿瘤，价格较贵、构建过程相对复杂且在实验中经常观察到转基因表达的转录失活现象。鉴于上述风险，所以传统载体连接的siRNA还不能满足临床长效性、经济性和安全性的需要，而将siRNA采用亲脂性化学基团等化学修饰后，具有某些优点，如提高siRNA的稳定性和RNAi活性、能抵抗核酸酶的降解作用、避免脱靶，siRNA可进行标记，利于被细胞摄取、不具有病毒载体潜在的风险性，方法简单、快速，需要时间短，获得的siRNA纯度高等，而逐渐引起人们的重视［10］。siRNA的化学修饰主要有以下四类:磷酸骨架修饰、核糖修饰、碱基修饰和锁核酸［11］。

3.1 磷酸骨架结构 连接在RNA磷酸骨架的磷酸二酯键(phosphodiester linkage)是核酸酶作用的关键化学键，而磷原子是核酸酶攻击的重要靶点，所以研究最多的化学修饰是磷原子，对磷原子稍加修改即会大大的影响酶的降解作用，如硫代修饰等。硫代修饰最初广泛应用于反义技术，来提高寡聚核苷酸对核酸酶的抗性，硫代磷酸是用一个硫原子取代磷酸二酯键的非桥氧原子，即P－S键代替P－O键，提高了siRNA抗核酸酶的能力，增加其稳定性。研究证实，核糖4'位O－S置换后的siRNA稳定性提高600倍，但对其RNAi的作用有一定程度的抑制。4'－S修饰在提高siRNA稳定性的同时，因其修饰碱基位置和数量的不同都可以产生不同程度的RNAi效果［12］。

3.2 核糖修饰 对核苷酸戊糖2'－OH的修饰是对siRNA最重要的修饰。siRNA在体内水解时，在RNA酶催化下，3'磷脂键断开，与2'－OH形成环状磷酸二脂，最终形成水解产物。核糖的2'位置可进行多种修饰，如氟、甲基等，可提高siRNA分子核酸酶抵抗力，提高其稳定性。DePaula D 等实验［13－22］指出，2'－OH不是siRNA发挥效用的必须基团，对siRNA所在单、双链的化学修饰都不会影响其基团沉默效果，而且5'端修饰效果强于3'端。在Allerson等［23］研究中，对 siRNA主链核糖残基2'位完全用甲氧基(2'－OMe)或氟(2'－F)进行取代，可增强其血奖中的稳定性及体外的RNAi活性，基因沉默效果是未经修饰siRNA的大约500倍。Czauderna等［24］等实验证明，siRNA的3’或5’末端经2'－OMe修饰，可增强该修饰siRNA抵抗血浆源性核酸酶的降解作用，且不降低RNAi干扰活性。

3.3 碱基修饰 siRNA与mRNA通过碱基互补之间形成氢键，发挥RNAi的作用，因此通过对碱基进行修饰，加强碱基与碱基之间的相互作用。在尿嘧啶的5’位点引入溴或碘是最常使用的碱基修饰方法，如5－溴－尿嘧啶和5－碘－尿嘧啶可加强腺嘌呤－尿嘧啶(A－U)之间的连接，提高碱基的相互作用，与靶mRNA的相互作用，增加RISC对后者的识别和剪切［25－26］。

3.4 锁核酸修饰 LNA(locked nucleic acid)锁核酸是一种新颖的寡核苷酸衍生物，LNA分子结构中含有一个或多个2'－O，4'－C－亚甲基－β－D－呋喃核糖核酸单体，核糖的2'－O位和4'－C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、胺亚甲基桥或硫亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3'－内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，从而增加磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对RNA、DNA有很好的识别能力和强大的亲和力、水溶性好、抗核酸酶降解能力及体内无潜在致癌性等优点。siRNA两端或中间位点经LNA修饰后，靶外基因沉默现象明显减少，更容易与RISC结合，血清半衰期更长、活性更高。

综上所述，siRNA的修饰方法可以归纳为以下几点:(1)磷酸骨架修饰主要为硫代修饰，可提高其抗水解酶降解能力，增强其稳定性;(2)核糖修饰主要是2'－OH和4'－O化学基置换、加长等，是对siRNA最重要的修饰;(3)碱基修饰是用5'溴－尿嘧啶可以提高与靶mRNA的相互作用，增加RISC对后者的识别和剪切;(4)LNA修饰siRNA两端或中间位点，亲和力提高、水溶性好、抗核酸酶降解能力加强。化学修饰能够提高生物的特征如稳定性、生物学分布和潜能性，这种修饰使得RNA治疗的发展成为可能，然而目前还是在实验阶段，应用于临床面临着一些挑战。

4 前景与展望

RNAi技术的应用:(1)使其可以作为研究基因功能的新工具，特异性的灭活或降低特异性基因的表达，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。(2)成为研究信号转导通路的新途径。联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号转导途径中不同基因的上下游关系。(3)成为开展基因治疗的新策略。作为一种古老的抗病毒机制，RNAi用于抗病毒治疗已取得一定进展。Zhou［28］报道了以趋化因子复合体CXCR4为靶向的siRNA阻止了HIV－1细胞融合。导致HIV－1失去抵抗大多数以趋化因子复合体为靶向的病毒抑制因子的能力。肿瘤是一种多基因疾病，可以将多种癌基因作为靶基因设计出相对应的siRNA。Krishnamachary等［29］将人工合成的 siRNA/HIF－1a导入结肠癌细胞，发现siRNA能高度抑制HIF－1a及其下游基因MMP－2等的表达，明显降低肿瘤细胞的侵袭能力。

虽然应用RNAi技术已经取得许多令人振奋的研究成果，但仍有多方面问题有待解决:(1)RNAi作用存在衰减现象;(2)RNAi在哺乳动物体内的应用尚缺乏器官靶向性;(3)RNAi具有高度特异性，但有时也会出现脱靶(off－target)现象［30］;(4)RNAi导入动物体内的方法及载体的选择还需要进一步优化;(5)RNAi技术中的siRNA或shRNA的导入可能激活体内干扰素反应基因，它被激活后就能够非特异性地全面抑制内源性mRNA的翻译，并导致细胞凋亡，但随着RNA干扰机制的彻底阐明，这些问题有望最终解决。相信在不久的将来，RNAi技术能完全成为最有效的基因治疗手段而应用于临床。

目前的siRNA应用的困境在于体内稳定性、靶向性、包膜穿透性均较差，副作用主要包括靶外效应和免疫刺激反应。化学修饰可以克服传统载体siRNA的缺点，在不影响RNAi活性的基础上，增加其稳定性、长效性，在siRNA的深入研究及临床治疗等领域具有积极和深远的影响。目前的siRNA应用的困境在于体内稳定性、靶向性、包膜穿透性均较差，不良反应主要包括靶外效应和免疫刺激反应。化学修饰siRNA具有传统载体不可比拟的优势，在siRNA的深入研究及临床治疗等领域产生积极和深远的影响。

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