多浆旱生植物霸王18S rRNA基因的克隆及序列分析

胡 静，谢俊仁，王锁民

(1.兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020； 2.中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室,甘肃 兰州 730046)

18S rRNA基因(rDNA)广泛存在于真核细胞中，是除病毒以外所有生物都具有的基因，在进化过程中表现出高度的保守性[1]。现已在许多高等植物中克隆了18S rRNA，如拟南芥(Arabidopsisthaliana)(GQ380689.1)、白银杨(Populusalba)(DQ371807.1)、小盘木(Galeariafiliformis)(AB233598.1)、驱虫苋(Cnidoscolusaconitifolius)(AB268093.1)及橡胶树(Heveabrasiliensis)(AB268099.1)等。18S rRNA在生物体内执行着重要的生物学功能[2]，它能与相关蛋白组成核糖体小亚基，然后通过核孔再转移至细胞质中参与核糖体循环。目前18S rRNA基因主要在中草药鉴定中被应用[3]。此外，18S rRNA是唯一具有信息分子和功能分子两种作用的编码核糖体基因，以连续排列方式存在于细胞内，结构和碱基排列复杂度适中，较易于进行序列测定和分析比较。因此，18S rRNA是研究物种进化关系比较简便的手段之一[4]。

Kranz和Huss[5]利用18S rDNA序列对蕨类植物的分子进化及蕨类植物与种子植物间的关系进行了研究，结果表明，石松类植物是单系分支，且是陆生维管植物的最早分支;相对于别的蕨类植物，松叶蕨属(Psilotum)与种子植物具有更近的亲缘关系。Chaw等[6]探讨了裸子植物的分子系统发育及种子植物的进化，Soltis等[7]利用18S rRNA序列系统阐明了被子植物的系统发育关系，而梁江等[8]通过18S rRNA基因序列分析不同豆科作物的进化关系，发现大豆相对于其他豆科作物在系统发育上处于比较原始的位置。可见，18S rRNA基因序列已逐渐成为研究生物进化的依据之一[9-10]。

霸王(Zygophyllumxanthoxylum)又称霸王柴，蒺藜科，是一种强旱生小灌木，为古老的荒漠残遗植物，起源于古非洲[11]，现主要分布在亚洲中部荒漠区[12]，是我国西北荒漠草原上的主要植被之一[13]。霸王作为古老残遗的抗旱植物有着十分重要的研究价值[14]，已受到广泛重视，在形态解剖学[15]、逆境生理[16]、分子生物学[17-18]、组织培养[19-20]和遗传多样性[12]等方面都开展了相关研究。然而，尚未见到有关霸王18S rRNA基因及分子进化方面的报道。为此，本研究克隆了霸王的18S rRNA基因，分析其序列结构，以期为霸王的生物进化研究提供依据。

1 材料与方法

1.1材料及试剂 霸王种子于2010年10月采自甘肃省治沙研究所民勤治沙综合试验站。PCR扩增试剂盒Adcantage®2 PCR kit购自Clonetech公司；凝胶回收试剂盒UNIQ-10及植物DNA提取试剂盒Ezup均购自上海生工生物有限公司；克隆载体pGEM-T Easy vector Kit 购自Promega 公司；其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2试验方法

1.2.1霸王基因组DNA的提取 以3周龄霸王幼苗叶为材料，参照Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒的操作说明提取霸王基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1.2.2PCR 扩增 参照Sogin[21]设计的18S rRNA通用引物，上游引物P1：CAACCTGGTTGATCCTGCCAGT，下游引物P2：CTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC。引物由上海生工合成。

PCR 反应体系：10× Buffer 5 μL，50× dNTP mix 1 μL，polymerase mix 1 μL，DNA 1 μL，P1、P2(10 pmol·L-1)各1 μL，加水至50 μL。PCR反应程序：94 °C 预变性5 min；94 °C 变性30 s、57 °C 退火30 s、72 °C 延伸2 min，31个循环；72 °C延伸5 min；4 °C 保存。取5 μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测，目的片段的回收和纯化按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒操作说明进行。

1.2.3PCR 扩增产物的克隆 将回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T载体，转化JM109后经含100 μg·mL- 1氨苄青霉素的LB固体培养基进行蓝白斑筛选，阳性克隆经PCR鉴定后，送至上海生工生物有限公司测序。

1.2.4核酸序列的分析 Blast搜索在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)网站上进行，序列的比较及系统进化分析在DNAMAN生物软件上进行。

2 结果

2.1霸王总DNA的提取 提取的霸王基因组DNA 的电泳结果显示(图1)，在15 000 bp以上位置出现整齐明亮的条带，说明基因组DNA 完整性好，没有降解，可作为PCR 扩增模板。

2.2霸王18S rRNA 基因序列的扩增和克隆 以霸王的总DNA 为模板，使用18S rRNA 的通用引物P1、P2进行PCR扩增。扩增产物经凝胶电泳检测发现约在1 800 bp处有一条亮带(图2)，与预测的目的片段大小一致，推测可能是霸王18S rRNA 基因片段。

图1 霸王总DNA的凝胶电泳图Fig.1 Electrophoresis of total DNA of Zygophyllum xanthoxylum

图2 18S rRNA 基因PCR产物凝胶电泳图Fig.2 PCR product of 18S rRNA gene fragment

将回收纯化的目的片段连接到pGEM-T克隆载体上，转化大肠杆菌JM109。从转化的平板上随机挑取3个克隆并提取质粒，进行PCR 扩增,得到的扩增片段大小约为1 800 bp(图3)。表明这些克隆为阳性克隆,可以进行测序。

图3 阳性克隆的PCR鉴定凝胶电泳图Fig.3 Positive clones electrophoresis of product by PCR

2.3测序结果及序列分析 测序结果显示，该序列长度为1 808 bp。Blast 比较结果(图4)表明，该片段与其他植物的18S rRNA 基因核苷酸序列的同源性均在96%以上，其中与之同源性最高的是驱虫苋(98%)、小盘木(98%)和橡胶树(98%)，表明所克隆到的片段为18S rRNA 基因片段，且进一步证明18S rRNA 是一种高度保守的基因。将该基因命名为Zx18S rRNA。

同源性分析(表1)与Blast 比较结果基本相一致，霸王与小盘木、驱虫苋及橡胶树同源性最高。系统进化树分析(图5)表明，霸王与三七(Panaxnotoginseng)的亲缘关系最近。

图4 Zx18S rRNA 与其他植物18S rRNA 基因核苷酸序列Blast比对部分结果Fig.4 Zx18S rRNA and 18S rRNA from other plants sequences producing significant alignments by Blast

表1 Zx18S rRNA与其他植物18S rRNA基因核苷酸序列同源性分析Table 1 Homology matrix of Zx18S rRNA and 18S rRNA from other plants %

图5 Zx 18S rRNA与其他植物18S rRNA的系统进化树分析Fig.5 Phylogenetic tree of Zx 18S rRNA and 18S rRNA from other plants

3 讨论

在真核生物分类和进化分子生物学的研究中，研究者将重点放在rRNA基因上，该基因编码核糖体结构RNA。真核生物有4种rRNA，它们的分子大小分别是5S、5.8S、18S和28S，分别具有大约120、160、1 900和4 700个核苷酸[22]。其中，18S rRNA作为编码核糖体RNA的基因在植物生命活动过程中起着重要的作用[3]。前人研究[4-8]表明，18S rRNA基因在核苷酸水平上具有高度的保守性和同源性。本研究得到的霸王18S rRNA 基因片段与其他植物18S rRNA基因核苷酸序列的同源性均在96%以上。由此可见，高等植物18S rRNA的基因非常保守。

生长在荒漠区的多浆旱生植物霸王具有极强的抗逆性，若要深入研究其抗逆基因资源，则要了解霸王的遗传背景。但是在GenBank数据库中未能搜索到有关多浆旱生植物如霸王、白刺(Nitrariatangutorum)的18S rRNA 基因序列，本研究结果填补了此空白，同时丰富了18S rRNA 基因研究的资料库。18S rRNA基因的核苷酸变异小，被认为最有希望成为解决早期动物、植物及微生物进化型式的工具[2]，因此，分离某一物种18S rRNA 基因并测序，就可以从不同生物的18S rRNA 的对比中得出关于生物进化历程的结论。本研究表明，与霸王18S rRNA基因同源性最高的驱虫苋(98%)、小盘木(98%)和橡胶树(98%)均为热带或亚热带物种，恰与霸王物种起源地为非洲[11]相吻合。在系统进化树中，霸王与三七处于同一分支上，三七起源于第三纪，属古热带残遗植物[23]，与霸王背景相似。但是，霸王从非洲迁移到亚洲，并主要分布在我国西北荒漠草原的原因仍需进一步探究。因此，本研究结果可为霸王进化和分子系统学研究提供序列参考，将有助于进一步揭示霸王这类抗逆性极强的古老荒漠残遗植物的进化历程及区系起源。

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