拒盐型牧草小花碱茅PutHKT2;1基因表达模式分析

李 剑，张金林

(兰州大学草地农业科技学院 草地农业生态系统国家重点实验室，甘肃 兰州 730020)

小花碱茅(Puccinelliatenuiflora)为禾本科碱茅属多年生草本植物，主要分布于我国东北和西北地区，能够在盐碱地正常生长，草质柔软，适口性好，是一种能够改良盐碱地的优良牧草[1-2]。研究发现,生长于盐渍生境下的小花碱茅具有很强的拒Na+能力，以保持其体内低的Na+浓度，增强其耐盐性[3-4]。Wang等[5]研究发现，小花碱茅根部对K+/Na+选择吸收能力很强，大约是小麦(Triticumaestivum)的2倍。Wang等[6]采用22Na+同位素示踪技术证明小花碱茅耐盐的主要生理机制是其根系能控制Na+内流，对K+有强的选择性，从而提高体内K+/Na+，而其耐盐的分子机制尚不清楚。生长于盐渍生境中的植物，其体内存在多种与耐盐相关的转运蛋白，其中高亲和性K+转运蛋白HKT是目前研究的热点。HKT蛋白是广泛存在于植物和一些原核生物中的一类超级蛋白家族[7-8]。根据异源表达系统中转运特性的差异，通常将HKT蛋白分为两大类：第一类以拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtHKT1;1研究最多，通常为Na+专一转运蛋白[9-11]；第二类以水稻(Oryzasativa)OsHKT2;1和小麦TaHKT2;1为代表，TaHKT2;1为K+-Na+共转运蛋白[12-13]，而OsHKT2;1是例外，为Na+转运蛋白[14-16]。HKT蛋白的离子转运特性与其结构密切相关，目前公认的8次跨膜结构模型[17]，及拥有8个跨膜螺旋和中间的4个P环，已经在拟南芥、水稻等植物中得到证实[18-19]。研究发现，在HKT蛋白的P环或离P环很近的区域上存在与K+、Na+选择性吸收相关的多个位点[18]，且关于第1个P环过滤器位置的甘氨酸或丝氨酸残基与离子选择性密切相关，具有甘氨酸残基的HKT通常为K+-Na+共转运蛋白，而具有丝氨酸残基的通常为Na+转运蛋白[20]，小花碱茅PutHKT2;1第1个P环处为甘氨酸，因此推测可能为K+-Na+共转运蛋白。

Na+是盐渍化土壤中的主要毒害离子，抑制K+吸收，引起渗透胁迫和离子胁迫，严重威胁植物的正常生长[8,21]。植物可以通过限制根部Na+吸收，减小Na+向地上部转运，通过再循环途径卸载地上部过多的Na+，将Na+区域化到地上部的特殊部位并积累或将Na+分泌到体外等诸多过程减轻盐渍胁迫[22]。HKT蛋白在这些过程中发挥重要作用，能够减轻胁迫对植物的损害[8,19,23-25]。

1 材料与方法

1.1材料处理 小花碱茅种子于2010年采自甘肃省张掖市临泽县白寨村盐碱地。挑选颗粒饱满的种子均匀地撒在筛网上，暗培养至发芽后转移至培养室中，浇灌Hoagland营养液。培养4周后，将幼苗移栽入样品处理盒中，适应2 d后施以各种处理。K+饥饿处理时，将KNO3从营养液中移除，NO3-用NH4NO3补齐。处理24 h后，分别取100 mg幼根和地上部，经无菌水冲洗后，置于干净滤纸上吸干水分，快速放入1.5 mL离心管中，经液氮速冻后转移至-70 ℃冰箱中保存或直接用于总RNA提取。培养室昼夜温度为28 ℃/22 ℃，光照周期16 h·d-1，光照强度约为600 μmol·m-2·s-1，空气相对湿度为60%～80%。Hoagland营养液组分：1 mmol·L-1KNO3，1 mmol·L-1NH4H2PO4，0.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O，0.5 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O，92 μmol·L-1H3BO3，18 μmol·L-1MnCl2·4H2O，1.6 μmol·L-1ZnSO4·7H2O，0.6 μmol·L-1CuSO4·5H2O，0.7 μmol·L-1(NH4)6Mo7O24·4H2O，59 μmol·L-1Fe-citrate。

1.2主要试剂 总RNA提取试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，cDNA第一链合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)，普通PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，UNIQ-10 PCR产物回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，pMD19-T Simple克隆载体(大连宝生物工程有限公司)，DNA ladder(北京天根生化科技有限公司)，大肠杆菌感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)，Escherichiacoli.DH5a菌株由兰州大学草类逆境生理与基因工程实验室保存。

1.3研究方法

1.3.1总RNA提取 总RNA的提取依照总RNA提取试剂盒说明书进行。用1.0%甲醛变性凝胶电泳鉴定其完整性，用核酸蛋白检测仪NanoDrop 1000检测其纯度和浓度。

1.3.2PutHKT2;1基因表达片段的扩增 反转录过程依据cDNA第一链合成试剂盒说明书进行。根据PutHKT2;1全长cDNA序列，利用生物软件(DNAMAN和Primer Premier 5.0)设计一对特异性引物P1和P2，目的片段长度为497 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。P1：5′-TGCACAGCCTCAGTCGAATCAGTAG-3′；P2：5′-ATTCCTCTTAAACTCTGCAGAACTC-3′。PCR反应体系：10× PCR Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl22.5 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL,10 μmol·L-1P1和P2各1 μL，Taq DNA polymerase(5 U·μL-1) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加无菌水至总体积50 μL。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物的回收和纯化依据胶回收试剂盒操作说明书进行，将回收到的PCR产物连接到pMD19-T Simple载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，之后在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选，将阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

1.3.3PutHKT2;1基因表达模式分析 将4周龄小花碱茅在①1 mmol·L-1K+和0 mmol·L-1Na+；②0 mmol·L-1K+和0 mmol·L-1Na+；③1 mmol·L-1K+和25 mmol·L-1Na+；④0 mmol·L-1K+和25 mmol·L-1Na+；⑤1 mmol·L-1K+和300 mmol·L-1Na+；⑥0 mmol·L-1K+和300 mmol·L-1Na+6种不同条件下处理24 h后收获，分别提取总RNA，立即反转录为cDNA于-20 ℃保存，用于表达模式分析。内参基因Actin参照王生银等[26]所扩增到片段，P3：5′-GTGGTCGTACAACTGGTATTGTG-3′；P4：5′-GCACCTCCAATCCAGACACTG-3′，片段长度598 bp。PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μL，25 mmol·L-1MgCl23 μL，2 mmol·L-1dNTP 5 μL,10 μmol·L-1P31 μL，P41 μL，Taq DNA polymerase(5 U·μL-1) 0.5 μL，cDNA 2 μL，加无菌水至总体积50 μL。反应程序：94 ℃ 2 min；94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。以Actin基因为内参，分析PutHKT2;1基因在不同处理下的表达情况。

2 结果与分析

2.1总RNA的提取与检测 从小花碱茅根和地上部提取总RNA，甲醛变性胶显示提取的RNA完整性较好；经NanoDrop 1000核酸蛋白检测仪测得OD260 nm/OD280 nm都在1.8～2.0，表明RNA纯度较高，很少有DNA和蛋白质污染，可用于下一步试验。

2.2PutHKT2;1基因表达片段的克隆 以cDNA为模板，用特异性引物P1和P2扩增出1条497 bp长的条带(图1)。测序结果表明，所克隆到的片段为PutHKT2;1基因片段目的片段上下均没有弥散，且没有引物二聚体生成。表明引物特异性非常高，完全满足后续表达模式分析实验。

图1 PutHKT2;1基因表达片段的克隆Fig.1 Cloning of expression fragment of PutHKT2;1

2.3PutHKT2;1基因在不同处理下的表达PutHKT2;1基因受K+饥饿诱导，可以在小花碱茅根中和地上部表达。在6种处理条件下，根中的表达量都比地上部高，说明PutHKT2;1基因表达存在组织特异性(图2、图3)。根中K+饥饿处理时，表达量最高，且明显高于其他处理下的表达量，在1 mmol·L-1K+或无K+条件下，根中PutHKT2;1表达量随着盐浓度的增大而减少。在不同处理条件下，地上部表达量相对较低，且变化幅度不大。

图2 PutHKT2;1在根中的表达模式图Fig.2 PutHKT2;1 expression pattern in the root

图3 PutHKT2;1在地上部的表达模式图Fig.3 PutHKT2;1 expression pattern in the shoot

3 讨论与结论

高亲和性K+转运蛋白HKT2;1能够控制根部Na+吸收，增强对K+的选择吸收能力，从而维持地上部高的K+/Na+，从而提高植株的耐盐性[8]。小麦PutHKT2;1基因首次被克隆后[12]，人们相继在水稻、大麦(Hordeumvulgar)和芦苇(Phragmitesaustralis)等植物中也发现了HKT2;1基因[14,27-28]。基因的表达模式分析与其生理功能密不可分。小麦TaHKT2;1基因主要在根皮层细胞、叶和茎中表达，说明高亲和性K+吸收可以在多种植物组织中进行；TaHKT2;1在根的皮层细胞中表达，暗示皮层细胞具有很高的吸收K+的活性；TaHKT2;1可以在叶维管组织的细胞层表达，说明TaHKT2;1能够参与地上部中K+的转运[12-13]。Laurie等[29]将反义的TaHKT2;1转入小麦后，转基因植株耐盐性增强，认为TaHKT2;1在整株水平上的生理功能是介导Na+的吸收，说明皮层细胞不仅能够吸K+，对Na+也有较高的吸收活性。Horie等[15]研究发现，水稻OsHKT2;1基因主要在根部皮层和内皮层中表达，在叶维管束中也有表达，受低K+条件诱导，在无K+时表达丰度最高，但同时加入Na+后，表达量急剧下调；进一步研究发现，水稻OsHKT2;1在整株水平上的生理功能是，在缺K+时，能够介导根部吸收有益Na+，部分代替K+的生理功能，这与OsHKT2;1基因在根部的表达量最高密切联系。另有研究也发现，水稻OsHKT2;1能够介导根部对Na+的高亲和性吸收[16]。本研究发现，小花碱茅PutHKT2;1主要在根中表达，地上部表达量较少，推测PutHKT2;1可能主要介导根部对离子的吸收；在无K+无Na+条件下，根中PutHKT2;1表达量最高，说明PutHKT2;1有可能参与根部对K+的高亲和性吸收。在1 mmol·L-1K+或无K+条件下，根中PutHKT2;1表达量随着盐浓度的增大而减少，在低盐浓度且K+饥饿时，PutHKT2;1可能参与小花碱茅根部Na+吸收，PutHKT2;1表达量较大；当盐浓度增大后，小花碱茅不再吸入过多的Na+进入体内，PutHKT2;1表达量降低，因此推测PutHKT2;1能够控制小花碱茅根部Na+吸收。下一步试验将对PutHKT2;1基因进行亚细胞定位，进一步探索小花碱茅PutHKT2;1的生理功能。

[1] Flowers T J.Improving crop salt tolerance[J].Journal of Experimental Botany,2004,55:307-319.

[2] 任伟，王志峰，徐安凯.碱茅耐盐碱基因克隆研究进展[J].草业学报，2010，19(5)：260-266.

[3] 王锁民.不同程度盐胁迫对碱茅离子吸收与分配的影响[J].草地学报，1996，4(3)：186-193.

[4] 石德成，殷立娟.盐(NaCl)与碱(Na2CO3)对星星草胁迫作用的差异[J].植物学报，1993，34(5)：144-149.

[5] Wang S M,Zhao G Q,Gao Y S,etal.Puccinelliatenuifloraexhibits stronger selectivity for K+over Na+than wheat [J].Journal of Plant Nutrition,2004,27:1841-1857.

[6] Wang C M,Zhang J L,Liu X S,etal.Puccinelliatenuifloramaintains a low Na+level under salinity by limiting unidirectional Na+influx resulting in a high selectivity for K+over Na+[J].Plant Cell and Environment,2009,32:486-496.

[7] Liu W,Schachtman D P,Zhang W.Partial deletion of a loop region in the high affinity K+transporter HKT1 changes ionic permeability leading to increased salt tolerance[J].Journal of Biological Chemistry,2000,275(36):27924-27932.

[8] Zhang J L,Flowers T J,Wang S M.Mechanisms of sodium uptake by roots of higher plant[J].Plant and Soil,2010,326:45-60.

[9] Uozumi N,Kim E J,Rubio F,etal.The ArabidopsisHKT1 gene homolog mediates inward Na+currents inXenopuslaevisoocytes and Na+uptake inSaccharomycescerevisiae[J].Plant Physiology,2000,122(4):1249-1260.

[10] Berthomieu P,Conéjéro G,Nublat A,etal.Functional analysis of AtHKT1 in Arabidopsis shows that Na+recirculation by the phloem is crucial for salt tolerance[J].EMBO Journal,2003,22(9):2004-2014.

[11] Sunarpi,Horie T,Motoda J,etal.Enhanced salt tolerance mediated by AtHKT1 transporter-induced Na+unloading from xylem vessels to xylem parenchyma cells[J].Plant Journal,2005,44(6):928-938.

[12] Schachtman D P,Schroeder J I.Structure and transport mechanism of a high-affinity potassium uptake transporter from higher plants[J].Nature,1994,370:655-658.

[13] Gassmann W,Rubio F,Schroeder J I.Alkali cation selectivity of the wheat root high-affinity potassium transporter HKT1[J].Plant Journal,1996,10(5):869-882.

[14] Horie T,Yoshida K,Nakayama H,etal.Two types of HKT transporters with different properties of Na+and K+transport inOryzasativa[J].Plant Journal,2001,27(2):129-138.

[15] Horie T,Costa A,Kim T H,etal.Rice OsHKT2;1 transporter mediates large Na+influx component into K+-starved roots for growth[J].EMBO Journal,2007,26:3003-3014.

[16] Garciadeblás B,Senn M E,Bauelos M A,etal.Sodium transport and HKT transporters: the rice model[J].Plant Journal,2003,34(6):788-801.

[17] Durell S R,Hao Y,Nakamura T,etal.Evolutionary relationship between K+channels and symporters[J].Biophysical Journal,1999,77(2):775-788.

[18] Kato Y,Sakaguchi M,Mori Y,etal.Evidence in support of a four transmembrane-pore-transmembrane topology model for theArabidopsisthalianaNa+/ K+translocating AtHKT1 protein, a member of the superfamily of K+transporters[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2001,98(11):6488-6493.

[19] Ren Z H,Gao J P,Li L G,etal.A rice quantitative trait locus for salt tolerance encodes a sodium transporter[J].Nature Genetics,2005,37(10):1141-1146.

[20] Mäser P,Hosoo Y,Goshima S,etal.Glycine residues in potassium channel-like selectivity filters determine potassium selectivity in four-loop-per-subunit HKT transporters from plants[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2002,99(9):6428-6433.

[21] 张宏飞，王锁民.高等植物Na+吸收、转运及细胞内Na+稳态平衡研究进展[J].植物学通报，2007，24(5)：561-571.

[22] 陈敏,彭建云,王宝山.整株水平上Na+转运体与植物的抗盐性[J].植物学通报，2008,25(4):381-391.

[23] Byrt C S,Platten J D,Spielmeyer W,etal.HKT1;5-like cation transporters linked to Na+exclusion loci in wheat,Nax2 andKna1[J].Plant Physiology,2007,143:1918-1928.

[24] Plett D C,Mller I S.Na+transport in glycophytic plants: what we know and would like to know[J].Plant Cell and Environment,2010,33(4):612-626.

[25] Hauser F,Horie T.A conserved primary salt tolerance mechanism mediated by HKT transporters: a mechanism for sodium exclusion and maintenance of high K+/Na+ratio in leaves during salinity stress[J].Plant Cell and Environment,2010,33(4):552-565.

[26] 王生银,张永超,李莉,等.拒盐型盐生植物小花碱茅肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析[J].基因组学与应用生物学,2009,28(4):673-677.

[27] Wang T B, Gassmann W,Rubio F,etal.Rapid up-regulation of HKT1, a high-affinity potassium transporter gene, in roots of barley and wheat following withdrawal of potassium[J].Plant Physiology,1998,118:651-659.

[28] Takahashi R,Liu S,Takano T.Cloning and functional comparison of a high-affinity K+transporter genePhaHKT1 of salt-tolerant and salt-sensitive reed plants[J].Journal of Experimental Botany,2007,58(15/16):4387-4395.

[29] Laurie S,Feeney K A,Maathuis F J,etal. A role for HKT1 in sodium uptake by wheat roots[J].Plant Journal,2002,32(2):139-149.