AG490对豚鼠巩膜成纤维细胞生长的影响△

朱子诚 柯根杰 温跃春 顾起宏 孙 冰

AG490(tyrphostin AG490)即a-氰基-(3，4-羟基) N-苄苯乙烯胺，是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，结构类似酪氨酸，是JAK2激酶抑制剂，可以特异性阻断 Stat3信号通路［1］。目前，AG490作为抗肿瘤药物已用于临床治疗，其毒副作用很小［2-3］，显示出很好的应用前景。我们的前期研究认为［4］，AG490作为阻断剂可能对胰岛素样生长因子-1诱导豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast，GSF)Stat3信号转导通路的激活起调控作用，但AG490对正常生理状态下细胞的生长状态有无影响尚不清楚，为此，本文拟采用不同浓度的AG490研究其对体外培养的GSF生长状态的影响，为其在眼科领域的临床开发应用提供初步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 GSF的原代培养及传代培养 取出生3 d内的豚鼠后部巩膜组织，剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块接种于25 cm2培养瓶壁上，加入含体积分数10%胎牛血清及双抗溶液的DMEM培养液，置37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。当细胞生长至80%融合时，用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化，传代。细胞鉴定:取2－3代细胞制备细胞铺片检测波形蛋白的表达。

1.2 台盼蓝染色检测细胞生存活力 传3代处于对数生长期的GSF经不同浓度(0 μmol·L－1、15 μmol·L－1、25 μmol·L－1、50 μmol·L－1、75 μmol· L－1)AG490处理48 h后，制成单细胞悬液，取9滴细胞悬液移入小试管中，加1滴4 g·L－1台盼蓝溶液混匀，在3 min内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数，不加AG490(即0 μmol·L－1AG490)的细胞作对照组。细胞存活率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。

1.3 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)测定细胞增殖能力 取3－4代培养的GSF，按100×106L－1接种于96孔板，每孔加100 μL。细胞在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中培养24 h后，用无血清的DMEM继续培养24 h以同步化。分别加入终浓度为15 μmol·L－1、25 μmol·L－1、50 μmol·L－1、75 μmol·L－1的AG490，空白对照组只加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM，继续培养，每个浓度设6个复孔。加药培养48 h后，弃上清液，每孔加入5 g· L－1MTT溶液20 μL，培养箱内继续孵育4 h，小心吸弃培养上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min后，酶联免疫检测仪上于492 nm波长检测各孔吸光度值。

1.4 细胞周期测定 取3－4代培养的GSF，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化后，以每瓶300×103个细胞接种于50 cm2培养瓶，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM液中培养24 h后，用无血清的DMEM洗1次，加入含25 μmol·L－1AG490和含体积分数1%胎牛血清的DMEM培养液培养，每瓶溶液量5 mL。对照组只加入含体积分数1%胎牛血清的DMEM，继续培养。加药48 h后终止培养。以2.5 g·L－1胰蛋白酶消化，将消化下来的细胞用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤2次，800 r·min－1离心5 min，弃上清，加入1 mL的磷酸盐缓冲液将细胞混匀，再加入2 mL无水乙醇立即振荡混匀，封口膜封闭，4℃过夜。上机检测前离心(800 r·min－1，5 min)，去除乙醇，磷酸盐缓冲液洗涤，800 r·min－1离心5 min，重复2次，调整细胞浓度为1×109L－1，各管加入5 g·L－1碘化丙啶(PI染液)，室温避光染色20 min，流式细胞仪测试分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析，测试数据用s表示，不同浓度组的细胞存活率比较采用卡方检验，多组比较采用单因素方差分析，组间均数比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞培养及形态学观察 组织块接种后5～7 d可见细胞从组织块边缘长出。原代培养细胞生长7～10 d接近长满瓶。倒置相差显微镜下观察，刚从组织块长出的GSF呈星形，培养数天及传代培养时细胞透亮呈梭形。在细胞密度较低时细胞排列成网状，密度较高时呈束状。

2.2 免疫细胞化学鉴定 波形蛋白染色阳性，胞浆内可见棕黄色阳性反应产物，证实所培养的细胞为GSF。

2.3 台盼蓝染色检测不同浓度的AG490对GSF存活率的影响 15 μmol·L－1、25 μmol·L－1的AG490对体外培养的GSF干预48 h，存活率分别是94.6%和94.1%，与对照组(95.5%)比较差异均无统计学意义(χ2=9.62、9.65，均为P＞0.05)，即使AG490浓度为50 μmol·L－1时，48 h后GSF存活率仍达87.1%。

2.4 MTT法检测AG490对GSF增殖能力的影响15 μmol·L－1、25 μmol·L－1的AG490对体外培养的GSF干预48 h后，未见促进或抑制增殖能力作用，与空白对照组比较差异无统计学意义(t=3.91、3.89，P＞0.05;图1)。

Figure 1 Dose-effect curve of AG490 on GSF proliferation AG490对GSF增殖的剂量效应图

2.5 AG490对GSF细胞周期的影响 对照组的G1期细胞百分比(80.2%)、S期细胞百分比(9.6%)以及反映细胞增殖活力的增殖指数(19.8%)，与实验组(25 μmol·L－1AG490)的G1期细胞百分比(82.2%)、S期细胞百分比(7.5%)以及细胞增殖指数(17.9%)比较，差异均无统计学意义(均为P＞0.05)(图2-图3)。

3 讨论

Stat3信号转导通路是近年发现的一类能与DNA结合的胞浆蛋白家族，是调控细胞增殖、分化及凋亡的重要细胞内信号通路［5-6］。Stat3蛋白是一种双功能的信号分子，不仅能够把细胞外的信号传递到细胞内，而且能直接参与细胞的基因调控。因此，理论上阻断Stat3信号途径任一环节，都可以抑制其上游众多酪氨酸激酶传递的信号以及下游多种靶基因的转录，从而成为防治众多疾病的理想侯选靶目标。目前主要方法包括直接阻断Stat3的功能和间接阻断Stat3活化。直接阻断包括反抑寡核苷酸(与Stat3的mRNA结合阻断其翻译)、诱饵寡核苷酸(与 Stat3竞争结合DNA)、显性负性蛋白(突变型蛋白功能超越并抑制了野生型蛋白的功能);间接阻断指从Stat3信号通路的不同阶段加以阻断，包括受体拮抗剂、酪氨酸激酶抑制剂、细胞因子信号转导抑制剂、磷酸酶调节、阻断Stat3二聚体形成、抑制二聚体核转位等。

Figure 2 Cell cycle picture of GSF before interfered by AG490.Figure 3 Cell cycle picture of GSF after interfered by AG490 图2 AG490刺激GSF前细胞周期图。图3 AG490刺激GSF后细胞周期图

AG490分子式为C17H14N2O3，相对分子质量为294.3，结构类似酪氨酸，可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位点，是JAK2激酶抑制剂，可以特异性阻断JAK-Stat3信号通路。本实验首先采用台盼蓝染色计数法和MTT法研究了不同浓度的AG490对体外培养的正常GSF生长状态的影响，以筛选最佳的浓度为后续实验做准备。结果显示在一定浓度范围(≤25 μmol·L－1)的AG490对正常GSF的生存率和增殖能力没有明显影响(P＞0.05)。有研究检测了不同浓度的AG490(25 μmol·L－1、50 μmol·L－1、75 μmol·L－1)对血管平滑肌细胞增殖的影响，结果显示，25 μmol·L－1浓度的AG490干预48 h后对血管平滑肌细胞增殖率无明显影响(P＞0.05)，直到浓度达到50 μmol·L－1时，AG490才显示对血管平滑肌细胞增殖有抑制作用(P＜0.05)［7］。杨爽等［8］研究也显示用40 μmol·L－1的AG490可以抑制心肌营养素-1刺激的心肌细胞肥大，但不影响心肌营养素-1的心肌保护作用。Huang等［9］采用Western blotting和组织免疫化学法结合荧光标记法，在体外正常视网膜组织块和急性高眼压作用后视网膜组织块内，研究JAK/Stat信号通路的激活状况和视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)的生存率，以及AG490和JAK抑制剂Ⅰ对RGC活力的影响，结果发现正常眼视网膜组织块内无激活的JAK/Stat信号通路，急性高眼压则可激活Stat3信号蛋白磷酸化，抑制JAK/Stat信号通路，且同样不会影响正常视网膜组织块内 RGC的生存。最为重要的是，Huang等［9］还进一步研究了AG490和JAK抑制剂Ⅰ对动物体内 JAK/Stat3信号通路的影响，结果也显示AG490可阻断急性高眼压引起的JAK/Stat3信号通路激活介导的RGC生存，而正常视网膜内RGC生存不需要JAK/Stat3信号通路激活介导，因此，AG490等抑制剂也不起作用。进一步说明AG490对正常生理情况下的细胞生长无明显抑制作用。

另外，AG490对GSF的细胞周期也没有明显影响。流式细胞技术测定细胞周期的结果表明，AG490作用于GSF后，G1期细胞百分比没有明显降低，而S期细胞百分比也无明显升高，表明AG490不能够促进细胞从G1期向G2期和S期转化。增殖指数代表了该细胞群体中增殖期细胞的数量(S+G2－M)占各期之和(G0/G1+S+G2/M)百分比，其中G2为DNA合成后期，M期为有丝分裂期，它表示细胞的增殖活性。GSF经一定浓度的AG490(25 μmol· L－1)处理后增殖指数没有显著升高或降低，其可能的原因是AG490没有激活静止态的G0/G1期细胞向S期转变，使DNA合成量增加，从而促进细胞的增殖。

Stat3信号转导通路在正常生理情况下，其激活是暂时的，往往只有数分钟或几小时，并处于严密调控之中，只有在长期的慢性病理情况下或致瘤信号的刺激下，Stat3才会被持续激活，恒定地存在于细胞核中，调控目标靶基因的转录，参与促进细胞的增长和抗凋亡作用［10］。另外，由于特定情况下，同一种生长因子可以通过不同的信号途径调控同一或多个靶基因的表达，不同的信号通路之间可能具有网络性的交互作用和时相及量效差异，因此，除了正常生理情况下细胞的增长很少需要激活Stat3信号蛋白外，另一个原因可能是生长因子等上游激活因子也同时通过其他途径代偿缺失的Stat3信号途径，使正常细胞生长不会受到影响。而AG490是一种特异性的阻断JAK2/Stat3信号转导通路的酪氨酸酶受体抑制剂，因此对正常生理情况下的细胞(几乎没有Stat3磷酸化形式存在)不起明显的毒副作用。

总之，本文研究了不同浓度的 AG490对正常GSF生长状态的影响，结果表明，在一定浓度范围内AG490对正常GSF的生长无明显影响。AG490促进体内细胞增长和抗凋亡的作用还有待于进一步采用严谨的设计和手段研究，为临床开发应用提供依据。

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