胶原交联对兔角膜碱烧伤后基质融解的影响

赵旭东 高晓唯 李文静 刘 莹 周 昕 杨 磊

角膜融解是多种致病因素所引起的非感染性角膜溃疡，可发生于多种角膜病中，其确切发病机制目前尚不清楚［1］，可能的机制为:(1)碱烧伤后大量的多形核白细胞浸润，胶原酶对角膜胶原的不断消化以及氧自由基对角膜细胞的毒性破坏［2］;(2)免疫炎性细胞［3］(包括淋巴细胞、Langerhan细胞等)和免疫分子［4］(如细胞因子、黏附因子、趋化因子等)相互联系、相互作用，形成复杂的免疫炎症网络，介导角膜的病理变化。这些都与胶原酶对角膜的破坏有关，抑制角膜融解可以减少角膜产生的抗原，从而减少白细胞聚集，打破恶性循环，达到治疗角膜融解的目的。

角膜胶原交联术是一种用于治疗圆锥角膜的方法，在体外实验中证实能增强角膜对多种酶的耐受，有抗菌、增强角膜硬度的作用［5］，但对碱烧伤后的角膜融解的治疗效果尚未见有报道。本实验采用家兔角膜碱烧伤后融解的动物模型，观察角膜胶原交联对角膜融解的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰大白兔25只，体质量(2.0±0.5)kg，雌雄不限，购自新疆医科大学实验动物中心。造模前裂隙灯及眼底镜检查眼部无异常。

1.1.2 主要仪器和试剂 角膜交联仪(巴西OPTO Electronics S.A.Opto-XLink角膜胶原交联治疗系统)。核黄素眼液的配制方法:由解放军474医院药剂科在无菌条件下用T500右旋糖酐(Pharmacia公司产品)2 g融解于10 mL生理盐水中，核黄素10 mg融解于200 g·L－1的T500右旋糖酐，配制成浓度为1 g·L－1核黄素眼液，密封，4℃保存备用。Ⅰ型胶原抗体(美国Santa公司)，SP试剂盒、DAB显色试剂盒及兔Streptavidin-HRP试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 将25只新西兰大白兔随机分为3组:正常对照组(5只10眼)、模型对照组(10只10眼)、胶原交联治疗组(10只10眼)。模型对照组和胶原交联治疗组右眼为造模眼，左眼不做处理;正常对照组双眼均不做处理。

1.2.2 碱烧伤动物模型的制备 术前15 min以50 mg·kg－1剂量的复方氯胺酮(50 g·L－1)和10 mg· kg－1盐酸氯丙嗪(25 g·L－1)肌肉注射麻醉成功后，4 g·L－1盐酸奥布卡因眼部表面麻醉。将浸润1 mol·L－1氢氧化钠溶液60 s、直径8 mm的滤纸片置于兔右眼角膜中央，约30 s后取下滤纸片，立即用生理盐水冲洗角膜约2 min。形成角膜中央边界清楚的圆盘状白色烧伤区，依据Hughes分度法确认中度碱烧伤模型建立。

1.2.3 胶原交联治疗过程 4滴氯霉素眼液和2滴20 g·L－1毛果芸香碱眼液滴眼后，以配置好的1 g· L－1核黄素眼液滴眼，每5 min 1次，共30 min。观察角膜呈黄绿色浸润后，打开角膜交联仪，垂直于角膜，距离45 mm，以370 nm波长紫外线A在角膜烧伤区8 mm直径区域，3 mW·cm－2的辐照度治疗30 min。治疗过程中1 g·L－1核黄素眼液滴眼，每5 min 1次。

1.2.4 给药方法 造模后，模型对照组滴核黄素眼液30 min后涂红霉素眼膏;胶原交联治疗组胶原交联治疗后涂红霉素眼膏。各组次日起氯霉素眼液滴眼，每天3次，抗感染治疗，均治疗28 d。

1.3 观察指标及检测指标

1.3.1 角膜混浊、角膜融解评分 碱烧伤造模成功后每日裂隙灯显微镜观察并记录角膜混浊情况，并进行角膜融解评分。角膜融解评分参照Pfister等［6］建立的标准，角膜混浊评分参照Holland等［7］建立的标准。

1.3.2 一般病理检查和免疫组织化学染色 造模成功后28 d，3组动物处死后摘取眼球，取角膜，行HE染色，观察角膜组织病理学改变。随机抽取未经染色的切片，脱蜡水化、抗原修复，免疫组织化学染色方法按兔 Streptavidin-HRP试剂盒说明书进行，DAB显色后苏木素复染。观察角膜各层中Ⅰ型胶原纤维的表达情况。角膜组织内出现棕黄色颗粒为阳性判定标准。在低倍视野下选取角膜组织，用Olympus BX41计算机彩色图像分析系统采集图像。

1.4 统计学处理 本文所得实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，率的比较采用χ2检验，各组间计数资料比较采用t检验，等级资料采用秩和检验，数据采用均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察 各组实验动物均无感染及意外死亡者。正常对照组观察期内未发现变化。模型对照组、胶原交联治疗组造模成功后即可见一边界清楚的角膜水肿混浊区，随后角膜水肿逐渐减轻，治疗期间，角膜上皮反复再生、剥脱。

2.1.1 角膜融解情况 观察期内模型对照组6眼角膜发生融解，胶原交联治疗组1眼发生角膜融解，两组角膜融解发生率比较差异有统计学意义(P= 0.029＜0.05)。模型对照组角膜融解出现的时间为造模后9～20(14±4)d，胶原交联治疗组角膜融解出现的时间为造模后23 d，两组比较差异无统计学意义(t=1.148，P=0.254＞0.05)。

2.1.2 角膜穿孔发生的时间 观察期内模型对照组角膜穿孔2眼，分别发生于造模后的21 d和25 d;胶原交联治疗组无角膜穿孔眼，两组比较差异无统计学意义(P=0.237＞0.05)。

2.1.3 角膜融解的评分 造模后28 d时，模型对照组角膜融解评分平均为2.0分，胶原交联治疗组为0.3分;两组角膜融解的临床评分经秩和检验，差异有统计学意义(z=－2.487，P=0.035＜0.05)。

2.1.4 角膜混浊评分情况 造模后5 d，模型对照组和胶原交联治疗组角膜的混浊程度相同。模型对照组造模后9 d角膜混浊开始加重，至后期角膜完全混浊。胶原交联治疗组自造模后7 d角膜混浊开始减轻，至治疗结束时，角膜混浊程度始终低于模型对照组。造模后28 d，模型对照组评分平均为4分，胶原交联治疗组评分平均为3分，经秩和检验差异有统计学意义(z=－3.559，P=0.002＜0.05)。

2.2 角膜HE染色检查 正常对照组:角膜各层层次清晰，角膜基质排列规则(图1A);模型对照组:角膜水肿，上皮增生明显，基质层破坏严重，胶原纤维发生退行性变，排列紊乱，角膜层间有嗜酸性颗粒物堆积，可见机化纤维，角膜基质层可见大量的颗粒性白细胞浸润(图1B);胶原交联治疗组:角膜上皮增生，前基质层可见胶原纤维破坏，但程度较轻，前部可见颗粒性白细胞浸润明显少于模型对照组，角膜基质层深部胶原纤维排列规则，角膜肿胀较轻(图1C)。

2.3 Ⅰ型胶原表达 正常对照组:Ⅰ型胶原在角膜基质层排列规则，层次清楚(图2A);模型对照组:胶原纤维发生退行性变，角膜基质全层排列紊乱，层间隙明显(图2B);胶原交联治疗组:前基质层可见胶原纤维破坏，后部排列整齐(图2C)。

Figure 1 Rabbit corneal tissue HE staining(×100).A:Normal control group，hierarchical layers of the cornea cleared，corneal stroma arranged regularly;B:Model control group，corneal edema appeared，epithelium was proliferated，the stroma damaged severely，the fiber arranged irregularly，and corneal stroma showed a large number of particles of leukocyte infiltration;C:Collagen cross-linking treatment group，corneal epithelium was proliferated，light fiber damage before the matrix layer was seen，anterior visible particles leukocyte infiltration was less than that in model control group，the deep corneal stroma fibers arranged regularly 兔角膜组织病理切片HE染色(×100)。A:正常对照组，角膜各层层次清晰，角膜基质排列规则;B:模型对照组，角膜水肿，上皮增生明显，基质层破坏严重，胶原纤维排列紊乱，基质层可见大量的颗粒性白细胞浸润;C:胶原交联治疗组，角膜上皮增生，前基质层可见胶原纤维破坏，但程度较轻，前部可见颗粒性白细胞浸润明显少于模型对照组，角膜基质层深部胶原纤维排列规则

3 讨论

角膜融解一直是眼科临床较为棘手的问题［8］，随着病情的发展可致角膜穿孔，最终造成永久的视力障碍。角膜融解的病因繁多，包括角膜碱烧伤、免疫因素、感染以及眼部手术等，因发病机制尚未完全明确，临床上还没有根治的办法。目前的药物对症治疗包括［9］:(1)抗炎治疗;(2)胶原酶抑制剂:依地酸二钠、半胱氨酸、基质金属蛋白酶抑制剂等;(3)促进胶原蛋白和组织细胞间质合成:维生素C、纤维连接蛋白;(4)白细胞浸润抑制剂:枸橼酸钠;(5)免疫抑制剂。这些治疗在体外实验中有一定效果，但临床治疗效果并不明显。

角膜胶原交联治疗使用核黄素为交联剂，选择370 nm波长的紫外线A照射后，核黄素被激发产生活性氧自由基，后者可进一步与角膜胶原纤维之间和内部各种分子相互作用形成共价键连接，增强角膜硬度［10］。超微结构显示交联后胶原纤维直径增加，角膜板层间的纤维连接增强，层内的纤维连接增加［11］。Spoerl等［5］在体外实验研究角膜经过胃蛋白酶、胶原酶和胰蛋白酶作用后，交联后的角膜分别在13 d、14 d和5 d出现融解，而未经处理的角膜分别在6 d、6 d和2 d出现融解。提示胶原交联或许可以应用于角膜溃疡的治疗。Spoerl等［5］和Schilde等［12］推测可能是由于交联之后胶原纤维之间形成新的共价键，形成新的分子空间结构，影响胶原酶对相应分子位点的破坏，从而使经过紫外光核黄素交联治疗后的角膜对抗各种酶消化作用的能力显著加强。

Figure 2 Expression of collagen typeⅠin rabbit cornea(×100).A:Normal control group，collagen expression located in corneal stroma and arranged regularly;B:Model control group，the collagen fiber had anaplasia，the whole corneal stroma arranged irregularly，layer gaps were clear;C:Collagen cross-linking treatment group，the collagen fibers in anterior corneal stroma were damaged，but which in posterior corneal stroma arranged regularly Ⅰ型胶原在兔角膜中的表达(×100)。A:正常对照组，表达位于角膜基质层，排列规则;B:模型对照组，胶原纤维发生退行性变，角膜基质全层排列紊乱，层间隙明显;C:胶原交联治疗组，前基质层可见胶原纤维破坏，后部排列整齐

本研究采用兔角膜中度碱烧伤角膜融解模型，观察角膜胶原交联术在治疗角膜融解中的作用。结果显示:角膜胶原交联治疗可使角膜碱烧伤后角膜融解发生率降低，角膜混浊的程度减轻。病理切片显示角膜胶原交联治疗后角膜上皮增生轻，炎性细胞浸润少，深层角膜破坏少。免疫组织化学染色显示治疗后角膜胶原排列整齐，破坏较模型对照组轻。角膜胶原交联治疗角膜碱烧伤的机制可能有两方面原因:(1)角膜经过交联，胶原纤维之间增加了共价键，胶原酶融解角膜能力降低，融解产物减少，打破了角膜碱烧伤后的恶性循环;(2)角膜胶原交联主要作用于前角膜基质层，可以使角膜对水合作用耐受增加，减少角膜水肿［13-14］，保护了深层角膜组织，故深层角膜基质炎性细胞浸润减轻，胶原纤维排列整齐。

本实验观察了角膜胶原交联治疗对角膜碱烧伤后角膜融解的作用，结果发现胶原交联治疗可抑制和延迟碱烧伤后角膜融解的发生和发展，减轻角膜胶原纤维的破坏及减少角膜组织中炎性细胞的浸润。本实验也存在一些不足之处，如观察时间较短、样本数量有限、角膜穿孔数量较少等。胶原交联术是治疗圆锥角膜的一种新方法，尽管在临床报道中没有发现明显的并发症［15］，但是胶原交联对碱烧伤后角膜的影响仍需要进一步研究。

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