高糖诱导人脐静脉内皮细胞中玻连蛋白的表达和细胞骨架重塑△

王玉风 杨 侠 董晓光

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病严重的微血管并发症之一。研究发现，随着DR的病情发展，不仅影响了患者的视觉特异性日常活动［1］，而且已成为工作年龄段人群致盲的主要原因［2］。因此从分子和基因水平寻找更有效的方法来预防和阻止DR的发生和发展具有重要意义。

视网膜缺血、缺氧引起多种细胞因子释放被认为是DR中视网膜新生血管形成的主要原因［1，3］。但生理、病理性的血管生长，除了与生长因子相关外，还与细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的相互作用密切相关［4-5］。ECM成分和细胞表面受体结合，可介导细胞黏附，诱导细胞的接触趋向性，使细胞发生定向迁移，这是血管生成中内皮细胞迁移的机制之一［5］。而玻连蛋白(vitronectin，VN)是ECM的一个重要组成成分，它可以同多种受体结合，参与细胞纤溶、黏附、增殖、迁移、凋亡等过程［6-8］。

Seiffert等［9］在研究鼠类胚胎发育过程中基因表达时，发现VN可能是中枢神经系统特有的一个血管标记物。本课题组在前期的动物实验中，制作了小鼠氧诱导视网膜病变模型，小鼠全基因组表达谱分析发现，VN在视网膜血管正常发育过程中及氧浓度变化的影响下均有明显的基因表达差异，并且在血管发育旺盛期和异常血管生长茂盛期的表达有显著差异，但目前尚无体外研究证明VN在正常和高糖环境下的表达也存在差异，也没有证实VN在视网膜新生血管病变中发挥何种作用。本研究模拟DR中内皮细胞所处的高糖微环境，建立高糖体外细胞培养模型，通过检测不同培养状态下人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中VN的表达水平，以及细胞骨架结构、细胞迁移能力、细胞成管能力的改变，初步探讨VN与高糖环境下HUVEC发生一系列改变的关系，为进一步证实VN的作用提供前期研究依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVEC由北卡罗来纳大学Cora-Jean S.Edgell惠赠。DMEM培养基干粉(美国Invitrogen公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Sigma公司)，注射用青霉素钠(哈药集团制药总厂)，注射用硫酸链霉素(山东鲁抗医药股份有限公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，VN小鼠抗人单克隆抗体(美国Santa Cruz生物技术公司)，山羊抗小鼠IgG抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，小鼠抗GAPDH抗体(上海康成生物工程有限公司)，Western blot发光剂(美国Thermo公司)，FITC-Phalloidin(鬼笔环肽)(中国联科生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培养与实验分组 用DMEM培养基、含体积分数10%FBS、100×103U·L－1青霉素和100×103U·L－1链霉素培养HUVEC。待细胞达80%融合时进行分组处理，正常组:常规培养HUVEC，使用 DMEM培养基、含体积分数2%FBS、100× 103U·L－1青霉素和100×103U·L－1链霉素培养，其中含葡萄糖浓度为25 mmol·L－1;高糖组:高糖培养HUVEC，使用DMEM培养基、含278 mmol·L－1葡萄糖、体积分数2%FBS、100×103U·L－1青霉素和100×103U·L－1链霉素培养，其中含葡萄糖浓度为50 mmol·L－1。

1.2.2 Western blot方法检测各组中VN蛋白表达

将HUVEC接种于6孔板中，分别在24 h和48 h时提取培养液上清中的蛋白和细胞总蛋白，制备电泳凝胶，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后进行转膜，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。以1∶500稀释的VN小鼠抗人单克隆抗体和1∶3000稀释的山羊抗小鼠IgG抗体孵育VN条带膜，以1∶2000稀释的小鼠抗GAPDH抗体孵育GAPDH条带膜。反应结束后用Western blot荧光剂发光、显影。利用Image J软件对显影结果进行分析。

1.2.3 免疫荧光细胞化学法观察各组中细胞微丝骨架F-actin的变化 将HUVEC接种于24孔板中，板中提前放入经过酸洗、高压灭菌处理的盖玻片，分别在24 h和48 h时，将24孔板中的培养液完全吸除，无菌PBS洗涤5 min×3次。40 g·L－1多聚甲醛室温固定 10 min，无菌 PBS洗涤 5 min×3次。50 g·L－1BSA室温封闭20 min。1∶200稀释的FITC-Phalloidin室温避光染色30 min，PBS洗涤5 min×3次，甘油封片，用荧光显微镜观察细胞微丝骨架F-actin的变化并照相。

1.2.4 划痕法检测各组中细胞的迁移能力 将HUVEC接种于24孔板中，在0 h时，用100 μL微量移液枪头对2组细胞进行垂直划痕，宽度控制在500 μm左右，PBS冲洗细胞2次，分别加入2组的培养液，置于37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养。在0 h、24 h和48 h时，对2组细胞划痕进行照相，随机选取6个视野计算迁移到划痕内的细胞数。

1.2.5 Matrigel法检测各组中细胞的成管能力将Matrigel基质胶置于4℃冰箱中2 h，使其完全溶解。向预冷的48孔板中加入Matrigel基质胶，每孔150 μL，37℃ 1 h成胶。将接种于6孔板中的细胞在分组处理后0 h消化，分别用2组的培养液重悬，以70×106L－1接种于已铺好胶的48孔板中，置于37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养。在6 h和12 h时，对2组细胞进行照相，随机选取6个视野计算形成闭合血管腔的数目。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学分析，实验数据以s表示，各样本首先进行方差齐性分析，再采用独立样本t检验对数据进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组VN蛋白表达 培养24 h时，高糖组中VN的蛋白表达量(1.295±0.080)高于正常组(0.893±0.119)，差异有统计学意义(t=－4.857， P＜0.05);培养48 h时，高糖组中VN的蛋白表达量(1.724±0.098)亦高于正常组(0.874±0.115)，差异有统计学意义(t=－9.710，P＜0.05，见图1)。

2.2 2组细胞微丝骨架F-actin变化 细胞微丝骨架F-actin包括三种结构:板状伪足、丝状伪足和应力纤维。板状伪足，是细胞边缘呈薄盖状扩张的平坦网状组织;丝状伪足，是细胞边缘直径约为0.15 μm的微刺状结构;应力纤维是位于板状伪足的基部或划界于细胞边缘的细丝状结构。免疫荧光细胞化学染色结合荧光显微镜观察发现，在培养24 h及48 h时，高糖组中贯穿于细胞全长的绳索状结构更加密集，且呈现出具有强穿透力的小簇状，细胞边缘微刺状结构也更明显，细胞边缘更加锐利(图2)。

2.3 2组细胞迁移能力 培养24 h时，正常组和高糖组中迁移到划痕内的细胞数分别为(198.000± 15.880)个、(242.000±11.130)个，差异有统计学意义(t=－5.495，P＜0.05);培养48 h时，正常组和高糖组中迁移到划痕内的细胞数分别为(293.000± 8.681)个、(334.000±10.863)个，差异也有统计学意义(t=－7.193，P＜0.05，见图3)。

Figure 1 VN protein expression in two groups 2组VN蛋白表达

Figure 2 F-actin immunofluorescence images in two groups(×400).A:Normal glucose group at 24 hours;B:High glucose group at 24 hours;C: Normal glucose group at 48 hours;D:High glucose group at 48 hours 2组F-actin结构分布免疫荧光图像(×400)。A:正常组培养24 h;B:高糖组培养24 h;C:正常组培养48 h;D:高糖组培养48 h

Figure 3 Cell migration images in two groups(×100).A:Normal glucose group at 24 hours;B:High glucose group at 24 hours;C:Normal glucose group at 48 hours;D:High glucose group at 48 hours2组细胞迁入划痕图像(×100)。A:正常组培养24 h;B:高糖组培养24 h;C:正常组培养48 h;D:高糖组培养48 h

2.4 2组细胞成管能力 培养6 h时，正常组、高糖组中形成的闭合血管腔数目分别为(91.000± 9.867)个、(120.000±9.813)个，差异有统计学意义(t=－5.163，P＜0.05);培养12 h时，正常组、高糖组中形成的闭合血管腔数目分别为(8.000±3.011)个、(19.000±3.209)个，差异也有统计学意义(t=－5.659，P＜0.05，见图4)。

3 讨论

一直以来视网膜缺血、缺氧引起的多种细胞因子的释放被认为是视网膜新生血管形成的主要原因，内皮细胞在细胞因子的刺激下，激活分泌蛋白酶，蛋白酶溶解血管基底膜和周细胞外基质蛋白，微血管内皮细胞通过血管基底膜迁移进入邻近细胞外间质形成新生血管芽［1，3］。但新生血管的形成是一个复杂的过程，还与其他多种分子生物学作用相关，如细胞和ECM间的相互作用。ECM是细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，主要包括胶原蛋白、纤连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、VN等多种成分。一旦内皮细胞汇集形成新的血管，这些ECM成分就形成基底膜以稳定和维持血管结构，这个基底膜紧紧黏附于由细胞组成的血管墙上，提供诱发信号，在新生血管的自我稳定中起重要作用。众多学者多关注ECM中胶原蛋白和FN的研究，而对VN的研究相对较少。VN是个多功能的黏附糖蛋白，它不仅存在于ECM中，还存在于血浆和血小板中，而且它的构象易变，在血浆中以单体形式存在，在血小板和ECM中多以多聚体形式存在［6-7］，而这种构象的改变与其功能密切相关。多聚体形式的VN，可以优先同一些受体，如整合素、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(urokinase plasminogen activator receptor，uPAR)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)等结合，而这些受体的作用多与细胞纤溶、黏附、增殖、迁移、凋亡等密切相关［6-8］，都参与视网膜新生血管疾病的发生、发展［10-12］。因此我们推测，VN作为连接多种血管形成相关受体的特异性配体，可能在血管形成过程中处于“节点”的关键位置，即VN可能是影响视网膜新生血管疾病的一个重要因子。

Figure 4 Blood vessels formation in two groups(×40).A:Normal glucose group at 6 hours;B:High glucose group at 6 hours;C:Normal glucose group at 12 hours;D:High glucose group at 12 hours2组细胞形成管腔的情况(×40)。A:正常组培养6 h;B:高糖组培养6 h;C:正常组培养12 h;D:高糖组培养12 h

人视网膜材料来源有限，进行人视网膜血管内皮细胞的原代培养也比较困难，很难获得纯化的人视网膜血管内皮细胞，传代过程中细胞性状也容易发生改变，且考虑到后期将进一步进行干扰实验，可能会影响细胞的生长状态，因此我们选用较易生长的HUVEC来进行研究。

本研究通过在体外增加培养液中葡萄糖浓度的方法来培养HUVEC，模拟DR中内皮细胞所处的高糖微环境，检测VN表达水平的改变。从Western blot结果可以看出，用含25 mmol·L－1葡萄糖的DMEM培养基培养HUVEC 24 h、48 h后，VN蛋白表达变化不明显，而用含 50 mmol·L－1葡萄糖的DMEM培养基培养HUVEC 24 h、48 h后，VN蛋白表达水平明显增高。这与我们前期小鼠氧诱导视网膜病变动物模型中，全基因组表达谱分析的VN表达趋势是一致的。

那么，高糖环境中VN的表达差异是否就说明VN与DR中由高糖血症引起的一系列病理改变有关呢?高糖血症及其引起的组织缺血、缺氧导致一系列病理改变，尤其是视网膜新生血管的形成，是DR的主要病理改变。新生血管形成的关键步骤之一是内皮细胞的迁移［5］，正常情况下内皮细胞有很强的极性，细胞排列整齐，细胞间黏附紧密。当细胞受到某些刺激后，如果细胞间连接变弱，细胞呈散在、弥漫状态生长，极性消失，细胞骨架就会发生剧烈变化，内皮细胞获得迁移的能力，促进新生血管的形成［5］。

细胞骨架(包括微管、微丝和中间纤维)是细胞运动、细胞形态、细胞分裂和跨膜信息传递的结构基础，是细胞外信号和核内基因表达之间的桥梁，尤其是微丝骨架，研究发现细胞分化和运动时微丝骨架会发生重构［13-15］。细胞骨架的重构实际上是细胞骨架蛋白发生变化的结果。因为细胞骨架蛋白表面承载着高密度的负电荷，一些蛋白和特殊配体使得细胞形成胞质膜-细胞骨架复合体，改变了细胞-细胞间、细胞-ECM间的连接，使得外界信号通过细胞骨架纤维的聚集或释放最终作用于细胞内的靶结构。因此，细胞骨架蛋白可以称为细胞表面催化剂和蛋白辅助因子［16］。F-actin属于微丝的结构蛋白，可以不断地变为板状伪足、丝状伪足和应力纤维结构，这三种结构对于驱动以肌动蛋白为基础的内皮细胞运动非常重要［5，17］。

本实验结果表明，在高糖培养HUVEC 24 h和48 h后，对细胞中的板状伪足、丝状伪足和应力纤维刺激更加明显，贯穿于细胞全长的绳索状结构更加密集，且呈现出具有强穿透力的小簇状，细胞边缘更加锐利。说明这些细胞的迁移能力更强，它们正处于或即将处于迁移状态。因此在高糖微环境中，HUVEC发生了细胞骨架重塑。那么HUVEC骨架结构的改变是否与VN的表达差异有关呢?Sastry等［18］早在1993年就发现，整合素可以通过β亚基的胞浆部分向细胞骨架传递信号，调节肌动蛋白细胞骨架的聚合作用。而整合素正是VN的受体之一，因此我们有理由相信，高糖环境中HUVEC的骨架重塑与VN表达水平的增高密切相关，干扰VN的表达有可能在一定程度上抑制细胞骨架重塑，但这些都需要进一步研究证实。

在新生血管形成的过程中，骨架重塑、细胞迁移、细胞成管这些过程都是密切相关的，本实验结果也证实了在高糖培养的HUVEC中，细胞迁移能力、成管能力增强。在此要特别说明，Matrigel法检测细胞成管能力实验中所选时间点之所以与其他实验步骤时间点不一致，是因为我们发现，6 h时细胞的成管现象较明显，12 h时细胞已聚集成团，其形成的管腔结构变粗，成管数量也减少，24 h后，各组中都不再形成完整的闭合管腔，这可能与Matrigel基质胶的特性有关(具体机制不明)。总体看来，HUVEC的成管趋势与VN的表达趋势是一致的，由此推测HUVEC成管能力的高低与VN的表达水平有关。

下一步实验我们将干扰VN的表达，观察其表达改变后，是否对高糖环境中HUVEC的细胞骨架、细胞迁移能力、细胞成管能力产生影响，以便进一步确定高糖环境中HUVEC发生的一系列改变是否与VN有关，进而探讨VN在DR发生、发展中的作用。

1 Lamoureux EL，Tai ES，Thumboo J，Kawasaki R，Saw SM，Mitchell P，et al.Impact of diabetic retinopathy on vision-specific function［J］.Ophthalmology，2010，117(4):757-765.

2 Yamagishi S，Imaizumi T.Diabetic vascular complications:pathophysiology，biochemical basis and potential therapeutic strategy［J］.Curr Pharm Des，2005，11(18):2279-2299.

3 Meleth AD，Agrón E，Chan CC，Reed GF，Arora K，Byrnes G，et al.Serum inflammatory markers in diabetic retinopathy［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(11):4295-4301.

4 Kim S，Bell K，Mousa SA，Varner JA.Regulation of angiogenesis in vivo by ligation of integrin alpha5beta1 with the central cellbinding domain of fibronectin［J］.Am J Pathol，2000，156(4): 1345-1362.

5 Lamalice L，Le Boeuf F，Huot J.Endothelial cell migration during angiogenesis［J］.Cric Res，2007，100(6):782-794.

6 Schvartz I，Seger D，Shaltiel S.Vitronectin［J］.Int J Biochem Cell Biol，1999，31(5):539-544.

7 Madsen CD，Sidenius N.The interaction between urokinase receptor and vitronectin in cell adhesion and signalling［J］.Eur J Cell Biol，2008，87(8-9):617-629.

8 Stefansson S，Lawrence DA.The serpin PAI-1 inhibits cell migration by blocking integrin alpha V beta 3 binding to vitronectin［J］.Nature，1996，383(6599):441-443.

9 Seiffert D，Iruela-Arispe ML，Sage EH，Loskutoff DJ.Distribution of vitronectin mRNA during murine development［J］.Dev Dyn，1995，203(1):71-79.

10 Santulli RJ，Kinney WA，Ghosh S，Decorte BL，Liu L，Tuman RW，et al.Studies with an orally bioavailable alpha V integrin antagonist in animal models of ocular vasculopathy:retinal neovascularization in mice and retinal vascular permeability in diabetic rats［J］.J Pharmacol Exp Ther，2008，324(3):894-901.

11 McGuire PG，Jones TR，Talarico N，Warren E，Das A.The urokinase/urokinase receptor system in retinal neovascularization: inhibition by A6 suggests a new therapeutic target［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(6):2736-2742.

12 Basu A，Menicucci G，Maestas J，Das A，McGuire P.Plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)facilitates retinal angiogenesis in a model of oxygen-induced retinopathy［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2009，50(10):4974-4981.

13 Theisen CS，Wahl JK 3rd，Johnson KR，Wheelock MJ.NHERF links the N-cadherin/catenin complex to the platelet-derived growth factor receptor to modulate the actin cytoskeleton and regulate cell motility［J］.Mol Biol Cell，2007，18(4):1220-1232.

14 Janmey PA.The cytoskeleton and cell signaling:component localization and mechanical coupling［J］.Physiol Rev，1998，78 (3):763-781.

15 Wheeler D，Sneddon WB，Wang B，Friedman PA，Romero G.NHERF-1 and the cytoskeleton regulate the traffic and membrane dynamics of G protein-coupled receptors［J］.J Biol Chem，2007，282(34):25076-25087.

16 Scaffidi AK，Moodley YP，Weichselbaum M，Thompson PJ，Knight DA.Regulation of human lung fibroblast phenotype and function by vitronectin and vitronectin integrins［J］.J Cell Sci，2001，114(Pt 19):3507-3516.

17 Small JV，Rottner K，Kaverina I.Functional design in the actin cytoskeleton［J］.Curr Opin Cell Biol，1999，11(1):54-60.

18 Sastry SK，Horwitz AF.Integrin cytoplasmic domains:mediators of cytoskeletal linkages and extra-and intracellular initiated transmembrane signaling［J］.Curr Opin Cell Biol，1993，5(5): 819-831.