MMP-9、TIMP-1在胃溃疡组织中的表达及与组织学的关系

赵景润，任晓燕，李复领，谢佳平

聊城市人民医院 1．消化内科;2．中心实验室，山东聊城252000

胃溃疡是消化内科的常见病，随着质子泵抑制剂及根除幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)治疗的应用，其治疗有了很大的进步，但仍有部分患者出现溃疡的复发及难治性溃疡，研究溃疡的愈合机制，对这一部分患者的治疗尤为重要。溃疡的愈合包括上皮细胞的增殖、迁移和分化等一系列细胞—基质的相互作用，而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)及其组织抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)在上皮细胞的再生、伤口的愈合中发挥重要作用，但在胃溃疡中的作用研究较少，本研究针对MMP-9和TIMP-1在胃溃疡组织中的表达情况及其与组织病理学间的关系进行初步研究。

1 材料与方法

1．1 病例资料 2010年1月～2010年10月我院胃镜检查发现的活动期胃溃疡患者50例作为实验组，其中男28例，女22例，年龄(47．3±14．3)岁，对照组为我院健康查体内镜表现正常者20例，其中男12例，女8例，年龄(49．1±13．8)岁，检查前2周无服用非甾体类药物、质子泵抑制剂、抗生素、铋剂和饮酒等病史。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1．2 实验材料 RPMI 1640培养液为美国Invitrogen公司产品，Lowry蛋白定量试剂盒、人MMP-9、TIMP-1 ELISA试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品，快速尿素酶试剂盒为福建三强化工有限公司产品，13C尿素呼气试验诊断试剂盒为北京勃然制药有限公司产品。RPMI 1640培养液使用前配制为含5%热灭活的胎牛血清，15 mmol/L HEPES缓冲液，100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素，10 mg/mL PHA。

1．3 胃镜检查获取病理组织 所有患者行胃镜检查，实验组在胃窦区取3块，1块用于H．pylori快速尿素酶检测，1块用于组织学检查并行 Giemsa染色检测H．pylori，1块用于组织培养检测MMP-9和TIMP-1。在胃溃疡边缘取2块，1块用于组织学检查，1块用于组织培养检测MMP-9和TIMP-1。对照组在胃窦区取3块。

1．4 H．pylori感染的确定 在快速尿素酶、13C尿素呼气试验及Giemsa染色三者中有二者为阳性则确定为H．pylori感染，三者均为阴性则定义为阴性，三者之一阳性者定义为阴性，但作为排除病例，不入组。

1．5 组织培养及MMP-9、TIMP-1的检测 将组织标本置于含3 mL RPMI 1640培养液的培养小瓶中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，收集培养液上清，于－70℃保存。以Lowry蛋白定量试剂盒测定组织标本的蛋白含量，以人MMP-9、TIMP-1 ELISA试剂盒测定培养液上清中MMP-9、TIMP-1的含量，结果以mg/mL表示。

1．6 组织学评价 组织标本进行HE染色，根据改良的悉尼标准［1］，评价活动度(中性粒细胞浸润)、炎症(单个核细胞浸润)、萎缩和肠上皮化生的程度，分为四级，0、1、2、3，分别代表无、轻度、中度和重度。

2 结果

2．1 MMP-9、TIMP-1在实验组与对照组间的表达情况 经单因素方差分析，MMP-9在实验组的胃溃疡部位的表达(51．6±20．3)mg/mL明显高于胃窦部位(35．9±6．5)mg/mL(P=0．000)，也高于对照组(23．1 ±12．5)mg/mL(P=0．001)。而TIMP-1在实验组的胃溃疡部位的表达(31．5±6．7)mg/mL与胃窦部位(29．6±4．4)mg/mL的差异无统计学意义(P=0．104)，但高于对照组(16．2±5．3)mg/mL(P=0．000)。

2．2 胃窦部MMP-9、TIMP-1在H．pylori阳性组与阴性组间的表达情况 H．pylori阳性者52例，阴性者18例，经t检验，胃窦部MMP-9在H．pylori阳性者的表达(37．7±4．9)mg/mL高于阴性者(16．6±3．4) mg/mL(t=16．797，P=0．000)。而TIMP-1在H．pylori阳性者的表达(28．5±5．9)mg/mL高于H．pylori阴性者(17．9±6．6)mg/mL(t=6．402，P=0．000)。

2．3 胃窦部MMP-9、TIMP-1表达与组织学分级的相关性 经Spearman等级相关分析，在胃窦部MMP-9和TIMP-1与组织学的活动性及炎症分级相关，而与萎缩、肠上皮化生分级等无相关性(见表1)。胃窦部MMP-9与TIMP-1的表达存在正相关(r=0．366，P= 0．002)。

表1 MMP-9、TIMP-1的表达与组织学分级的相关性分析Tab 1 Correlation of MMP-9 or TIMP-1 expression w ith gastric histological degrees

3 讨论

防治消化性溃疡的复发依然是治疗消化性溃疡的一大难题。研究表明，在根除H．pylori治疗后溃疡的年复发率为6．45%，H．pylori阳性的溃疡年复发率可达23．33%［2］。溃疡的修复可分为四个相互重叠的过程:凝血期、炎症期、移行增殖期(包括基质的沉积)和重建期，在此期间，MMPs是细胞外基质和基底膜的主要降解酶，参与组织再塑形和修复、炎症细胞的募集及促进上皮再生等［3］。已有研究发现，MMP-9是上皮再生的关键因素之一，过度表达的MMP-9与上皮再生缺陷有关，并降低连接复合物的完整性，影响溃疡愈合的质量。愈合质量差，是溃疡复发的根源。本研究采用组织培养的方法，观察溃疡微环境下MMP-9、TIMP-1的表达，较血清学测定更能反映溃疡部位 MMP-9、TIMP-1的变化。我们发现，在胃溃疡部位的MMP-9浓度明显升高，MMP-9的表达在胃溃疡部位高于溃疡组的胃窦部，同时高于对照组的胃窦部。而TIMP-1在胃溃疡部位、胃窦部无差异，但高于对照组的胃窦部。在大鼠乙醇急性胃溃疡模型中，随TNF-α、IL-6的增加，MMP-9、MMP-2分泌增加，溃疡的严重性与乙醇的用量、MMP-9、MMP-2的活性呈正比，MMP-9和MMP-2的活性降低与 TIMP-1、TIMP-2的表达增加有关［4］。在小鼠非甾体类药物相关溃疡模型中，同样发现伴随着炎症细胞的浸润及黏膜的破坏，MMP-9、MMP-3活性增加［5］。

我们的研究还发现，H．pylori阳性者其MMP-9、TIMP-1的表达明显高于阴性者。在H．pylori感染的胃炎患者中也发现MMP-8、MMP-9、中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、MMP-2及TIMP-1表达的变化［6］。而在儿童型胃炎中的研究发现，MMP-9基因1562C/T多态性在慢性胃炎组中，C/C基因型携带者发生H．pylori感染的风险是T等位基因(C/T+T/T)携带者的3．1倍，该基因位点的C/C基因型携带者可能与H．pylori易感性相关［7］。

进一步分析发现MMP-9、TIMP-1的表达与组织学的炎症及活动度分级相关，提示局部的 MMP-9和TIMP-1的表达与H．pylori感染引起的炎症活动有关。可能的原因是H．pylori感染引起胃黏膜产生炎症细胞及因子，刺激黏膜产生MMPs。在对胃上皮细胞系的研究中发现，H．pylori感染可激活NF-κB导致MMP-9基因转录。而在H．pylori根除后，MMP-9水平显著降低［8］。

胃窦部MMP-9与TIMP-1的表达存在正相关，提示TIMP-1是对MMP-9的适应性调节。我们假设，在溃疡形成早期，MMP-9的量及活性增加，主要来源于炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞等，通过降解细胞外基质调节基质与细胞间的黏附作用，刺激细胞迁移来促进上皮再生。而在慢性溃疡中，损伤和修复共存，此时MMP-9的高表达会阻止伤口的自发愈合，TIMP-1表达增加抑制MMP-9的活性有利于溃疡愈合。加强MMPs及TIMPs在胃溃疡发病机制中的作用研究，有可能发现提高溃疡愈合质量的途径，开发新的治疗药物，进一步降低溃疡的复发。

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