早期低氧培养对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响

辛志敏 张全乐 孙莹璞 金海霞 宋文妍

郑州大学第一附属医院生殖医学中心(450052)

在人类胚胎培养中，主要提供两种气体环境:一种是5%CO2，其余为空气(20%O2);另一种5%CO2，5%O2和90%N2(5%O2)的混合气体。对小鼠、羊和牛等动物研究证实，将空气中氧气的浓度降至5% ～7%有利于胚胎发育［1］。然而 Dumoulin等［2］在人类胚胎培养过程中发现，低氧培养对于第2天及第3天移植的胚胎妊娠率并无明显影响，因此有学者认为在人胚胎发育早期可能对较高浓度O2产生的毒性不敏感，第3天以后的囊胚培养给予5%O2低氧培养较为合理。但Leoni等［3］的研究发现人卵子在20%O2的高氧条件下授精后，其囊胚的发育潜能严重破坏，该研究表明在胚胎发育早期由高浓度O2产生的破坏已经存在。本研究对第3天移植胚胎于两种气体环境下培养的发育潜能进行比较，以期发现低氧环境对胚胎早期发育及妊娠率的影响。

1 资料与方法

1.1 病例选择

2009年12月～2010年6月在本中心接受常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)619个周期。不孕原因为输卵管盆腔因素、免疫因素及原因不明因素，排除严重的男性因素。根据气体培养环境分为两组:20%O2组，5%O2组。

1.2 方法

1.2.1 临床方案 两组对象均采用常规长方案超排卵，卵泡成熟后肌注人绒毛膜促性腺激素(hCG)，36～38h阴道B超引导下取卵。

1.2.2 卵子受精及胚胎培养 卵子和胚胎培养采用瑞士Vitrolife公司G系列序列培养基，精液处理采用密度梯度离心法。卵子捡出洗涤后放入培养液中置入5%CO2(20%O2)培养箱，取卵2～4h后行短时授精，受精4h观察两极体，受精17～20h进行受精观察和原核期评分，出现两个原核(2PN)为正常受精。观察受精后将胚胎随机放入5%CO2(20%O2)培养箱和5%CO2，5%O2和90%N2的混合气体(5%O2)培养箱培养至第3天移植，第2天及第3天各评估胚胎1次。移植2周后验尿hCG，阳性者为生化妊娠，移植5周后B超检查见孕囊及胚芽诊断为临床妊娠。

1.2.3 胚胎评级 所有胚胎均在相对固定时间进行形态评价。按Brinsden［4］标准，卵裂期胚胎评分系统评估D2/D3胚胎质量。Ⅰ级，胚胎卵裂球均匀规则，胞质均质透明，透明带完整，胚胎无或仅有极少(＜5%)碎片;Ⅱ级，卵裂球形态轻度不均匀，胞浆折光性有轻微变化，碎片＜15%，透明带完整;Ⅲ级，胚胎内碎片＜20%，其余卵裂球形态同II级，透明带完整;Ⅳ级，胚胎内碎片＞20%，碎片外卵裂球具有活细胞特征，胞浆折光性有较大改变，胞浆变黑、颗粒不均匀;Ⅴ级，受精延迟的胚胎，或受精失败后第2天进行重新受精发育而来的胚胎;Ⅵ级，胚胎无活性，卵裂球退化、皱缩、色深。

1.2.4 胚胎移植 第3天按胚胎分级标准选择胚胎，Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎。根据女方的年龄及周期移植2～3个形态学评分最佳(首选Ⅰ和Ⅱ级)的胚胎，剩余的优质胚胎行冷冻保存。

1.2.5 妊娠结局 移植后14d测血 hCG水平 ＞50U/L为生化妊娠，2周后B超见到孕囊为临床妊娠，妊娠3个月内流产为早期流产。

1.2.6 率的计算 优质胚胎率=优质胚胎数/2PN卵裂数×100%;胚胎利用率=可利用胚胎数(用于移植及冷冻的胚胎)/2PN卵裂数×100%;多胎率=多胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%;活产率=活产周期数/临床妊娠周期数×100%。

1.3 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两样本均数比较采用t检验，率的比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 一般情况比较

20 %O2组221例，5%O2组398例。两组对象年龄、不孕时间、Gn启动剂量、获卵数、移植胚胎数及hCG日内膜厚度差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.2 气体培养环境对IVF及胚胎发育的影响

两组受精率、卵裂率、胚胎利用率比较，差异无统计学意义(P＞0.05);5%O2组的优质胚胎率、临床妊娠率及活产率均高于20%O2组(P＜0.01)。见表2。

表1 两组对象一般情况比较(±s)

表1 两组对象一般情况比较(±s)

分组年 龄(岁)不孕时间(年)Gn启动剂量(支)获卵数(枚)移植胚胎数(个)hCG日内膜厚度(mm)20%O2组(n=221) 31.36 ±4.44 4.86 ±3.42 2.68 ±0.47 10.78 ±5.1 2.1 ±0.2 9.8 ±3.2 5%O2组(n=398) 31.57 ±4.49 4.80 ±3.23 2.70 ±0.62 10.45 ±6.2 2.2 ±0.1 10.8 ±2.4 P ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表2 两种O2培养环境对IVF结局的影响(%)

3 讨论

O2是输卵管和子宫环境的一个重要组成部分，对胚胎发育的调节有重要作用。无论受精卵的发育还是已进入多细胞阶段的胚胎发育都需要在一定合适的O2浓度下进行，浓度过高或过低都不利于发育。兔子、啮齿类动物的输卵管中氧分压在4.67～8.00kPa(5% ～8%)，恒河猴子宫中的氧分压更低为1.5% ～2%。兔子子宫中的O2浓度在胚胎种植时会下降，从5.3%降到3.5%。已有研究表明在胚胎发育过程中将气相环境中的O2浓度由大气水平(20%)降到生理水平(5%)可提高胚胎的发育能力［1，2］。

本研究比较低氧(5%CO2+5%O2+90%N2)环境与含20%O2的高氧环境(5%CO2的空气)对人胚胎发育的影响，结果发现其受精率、卵裂率及胚胎利用率无差异，但优质胚胎率与临床妊娠率及活产率有明显差异(P＜0.01)。优质胚胎率的提高提示5%O2培养环境可能有助于提高胚胎的发育潜能。这可能是由于处于高氧环境时，培养液中的氧自由基较高所致，氧自由基对胚胎有毒害作用。已有的研究表明:20%O2培养环境下，由于氧浓度过高，加速培养液中过氧化物形成，过氧化物通过过氧化膜脂损伤胚胎膜表面，还可使酶失活、DNA损伤导致胚胎异常发育［5～7］。而低氧条件可能有助于减少氧自由基的产生，从而促进胚胎的早期发育。John等［8］关于两种气体环境对鼠胚发育影响的研究发现，在小鼠胚胎发育的不同阶段，过氧化物的产生量不同，胚胎对过氧化物的敏感程度也不同。过氧化物产生的两个高峰是受精时及2PN期，2PN阶段若其含量过高则会引起胚胎停育。Dumoulin等［2］在人类囊胚培养过程中发现对于8PN以前的胚胎，采用两种O2浓度培养并无明显差异，但5%O2环境中人类囊胚的形成率会显著提高［10］。因此，Abeydeera等［9］提出早期胚胎的体外培养宜采用序贯培养方式，即桑椹胚以前在20%O2环境下培养，而桑椹胚以后的阶段宜在5%O2环境中培养。但 Ciray等［10］的研究发现:与受精后第3天行5%O2培养相比较，从受精开始即进行低氧培养明显提高其第5天的囊胚形成率及优质囊胚率。由于本中心常规第3天移植，因此无数据评估两种气体环境下第5天囊胚形成率的差异，但对于第3天移植胚胎培养结果表明，5%O2培养环境明显提高其优质胚胎率及临床妊娠率。因此笔者推测在胚胎发育早期进行低氧培养可能有助于改善胚胎活力和形态，促进胚胎的发育，形成较多的优质胚胎，从而有利于第5天囊胚的形成。如果在胚胎发育早期于20%O2环境下培养，过氧化物的产生可能会影响胚胎早期的代谢及基因表达，而这种损害可能在桑椹胚期或囊胚期明显表现，最终影响囊胚形成［11］。

因此，本研究认为在胚胎体外培养的早期即应行5%O2环境培养，有利于提高胚胎发育潜能，提高妊娠率。当然，研究还应包括多种因素，如患者的周期数、精子的质量等，以更客观地了解两种气体培养环境对胚胎发育的影响。

1 Fischer B，Bavister BD.Oxygen tension in the oviduct and uterus of rhesusmonkeys，hamsters and rabbits［J］.J Reprod Fertil，1993，99:673-679.

2 Dumoulin JCM，Meijers CJJ，Bras M，etal.Effect of oxygen concentration on human in vitro fertilization and embryo culture［J］.Hum Reprod，1999，14:465 -469.

3 LeoniGG，Rosati I，Succo S，et al.A low oxygen atmosphere during IVF accelerates the kinetic of formation of in vitro produced ovine blastocysts［J］.Reprod Domestic Anim，2007，42:299 -304.

4 Brinsden PR.A textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction［M］.New York:The Parthenon Publishing Group Inc，1999:196.

5 Bedaiwy MA，Falcone T，Mohamed MS，et al.Differential growth of human embryos in vitro:role of reactive oxygen species［J］.Fertil Steril，2004，82:593 -600.

6 Johnson MH，Nasr-Esfahani MH.Radical solutions and cultural problems:could free oxygen radicals be responsible for the impaired development of preimplantation mammalian embryos in vitro?［J］.Bioessays，1994，16:31 -38.

7 Burton GJ，Hempstock J，Jauniaux E.Oxygen，early embryonicmetabolism and free radical- mediated embryopathies［J］.Reprod Biomed Online，2003，6:84 -96.

8 John CM，Dumoulin JCM，Chantal JJ，et al.Effect of oxygen concentration on human in - vitro fertilization and embryo culture［J］.Human Reproduction，1999，14(2):465 -469.

9 Abeydeera LR，Day BN.Fertilization and subsequent development in vitro of pig oocytes inseminated in a modified tris-buffered medium with frozen - thawed ejaculated spermatozoa［J］.Biol Reprod，1997，57:729-734.

10 Ciray HN，Akeoy T，YaramanciK.In vitro culture under physiologic oxygen concentration improves blastocyst yield and quality:a prospective randomized survey on sibling oocytes［J］.Fertility and Sterility，2009，91(4):1459 -1461.

11 MeintjesM，Samuel J，Chantilis S，et al.A controlled randomized trial evaluating the effectof lowered incubator oxygen tension on live births in a predominantly blastocyst transfer program［J］.Human Reproduction，2009，24(2):300 -307.

［责任编辑:张 璐］