脆性X智力低下蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

李芳芳 郭 永 崔芳芳，3 丁 宁 张 嵘 邹检平，*

1.国家人口计生委科学技术研究所(北京，100081);2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院;3.河南大学药学院

脆性X综合征(FXS)是一种常见的遗传性智力低下综合征，其发病率仅次于唐氏综合征，男性为1/4 000，女性为 1/6 000［1］。FXS 患者在智障人群中所占比例为2.6% ～8.7%［2］，目前尚无有效的治疗方法，国外非常重视 FXS的筛查，以早期检出FXS患者，针对性地对患儿进行生活技能训练。有些国家(如以色列、芬兰)已在孕妇中进行常规筛查，防止患儿出生［3］。早期进行FXS筛查诊断可以对患儿进行早期干预，同时，对其家庭进行完善的基因型检测，可以指导优生优育，防止智力低下人口的出生，从而提高人口素质［4］。因此深入研究FXS，开发一种快速、简便、价廉、可靠的诊断方法意义深远。脆性X智力低下蛋白(FMRP)在成人和胎儿大脑和睾丸组织内都有高水平表达［5］，因此本研究中选择以人脑 cDNA文库为模板进行 PCR扩增，获得FMR1基因后在大肠杆菌表达系统中完成FMRP重组表达，经亲和纯化得到GST-FMRP融合蛋白，为下一步FMRP抗体的制备以及FXS的快速、高通量检测方法确立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 GST融合蛋白的表达载体pGEX-6P-1由本所张传领博士惠赠;表达宿主菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞购自北京天根公司。1.1.2酶与试剂 人脑 cDNA文库(质粒 DNA)和DNA marker购自TaKaRa;谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B凝胶纯化柱及填料购自GE Healthcare;苯甲基磺酰氟(PMSF)、还原型谷胱甘肽、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、二硫苏糖醇(DTT)、溶菌酶及十二烷基肌氨酸钠(NLS)购自Merck;PhusionTM超保真DNA聚合酶、限制性内切酶、dNTP、T4 DNA连接酶及蛋白Ladder购自NEB;质粒提取及胶回收试剂盒购自QIAGEN;0.45μm PVDF膜及鼠抗人 FMRP单克隆抗体购自Millipore;鼠抗GST单克隆抗体及辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自中杉金桥公司;Western blotting发光试剂购自SANTA CRUZ;其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3 特异扩增 FMR1的引物 根据 FMR1 cDNA序列合成特异性上下游引物，在其5'和3'末端分别引入限制性内切酶EcoR I和Sal I的识别位点，所有引物均由 Invitrogen公司合成。上游引物:5'-CCGGAATTCGAGGAGCTGGTGGTGGAAG-3';下游引物:5'-CGCGTCGACTTATCCATTCACGAGTGGTTGC -3'。

1.2 方法

1.2.1 重组表达质粒pGEX-FMR1的构建 以人脑cDNA文库为模板PCR扩增FMR1:98℃预变性30s，98℃变性 10s，65℃ 退火 30s，72℃ 变性 45s，35个循环后72℃10min。回收纯化以上PCR产物，用EcoR I和Sal I双酶切;与同样用EcoR I和Sal I双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，构建出表达FMRP前端融合GST蛋白的重组表达载体，转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞。菌落PCR进行阳性克隆检测，提取阳性克隆的pGEX-FMR1质粒后进行测序确认。

1.2.2 融合蛋白的诱导表达 将pGEX-FMR1质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，挑取单克隆，摇床220rpm/min、37℃培养过夜后以1:50接种于50m l LB培养基，继续培养约2h至 OD600=0.4～1.0，加入终浓度为0.5mM 的 IPTG，诱导 1、3、5、7h各取1ml菌悬液4 000rpm/min离心10min收集菌体，加入500μl 1×SDS上样缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM DTT，2%SDS，0.1% 溴酚蓝，10% 甘油)，沸水煮5min后10%SDS-PAGE进行融合蛋白检测。以pGEX-6P-1空载体转化BL21(DE3)pLysS细胞作为对照，同时每组设立以等体积H2O代替IPTG的非诱导阴性对照。

1.2.3 融合蛋白的纯化 挑取单克隆接种培养过夜后以1:50接种于50m l LB培养基，继续培养至OD600=0.4 ～1.0，加入IPTG 终浓度为0.5mM 诱导7h，将培养物4 000rpm/min离心5min收集菌体，以5ml冰浴的 STE(10 mM Tris- HCl，pH 8.0，150 mM NaCl，1mM EDTA)洗涤菌体一次，以 3ml含100μg/ml溶菌酶的 STE重悬，冰浴15min后加入DTT至终浓度5mM，PMSF至终浓度1mM，10%NLS至终浓度1.5%。涡旋5～10s混匀，冰上超声破碎30s，间隔 90s，共 5 次，13 000rpm/min 4℃ 离心10min。取上清，加入1ml 10%TritonX-100(终浓度3%)，涡旋5～10s，准备上柱加样。

以5ml PBS洗谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B填料，小于2 000rpm/min离心，弃上清，PBS重复洗涤两次。以储存缓冲液(50mM HEPES缓冲液，pH 7.4，150mM NaCl，5mM DTT，10% 甘油)重悬装柱，加入处理好的样品。以1ml Elution缓冲液(75mM HEPES 缓冲液，pH 7.4，150mM NaCl，5mM DTT，10mM还原型谷胱甘肽，0.1%Triton X-100)洗脱。收集洗脱液，每管约100μl，SDS-PAGE检测每管洗脱液。

2 结果

2.1 重组表达质粒pGEX-FMR1的构建

以人脑cDNA文库为模板进行PCR扩增获得FMR1基因(图 1)。经胶回收、双酶切、连接至pGEX-6P-1载体转化BL21(DE3)感受态细胞。菌落PCR检测出两个阳性克隆(图2)，琼脂糖凝胶电泳显示产物略小于2 000bp，与预期结果一致。提取阳性克隆的质粒由华大基因公司进行序列测定，确保编码区准确、无突变。测序结果经NCBI在线BLAST，结果显示11号阳性克隆序列与FMR1 transcript variant ISO10一致，为1 640bp，12号阳性克隆序列与transcript variant ISO7一致，为1 836bp。

图1 PCR扩增的FMR1基因的凝胶电泳图

图2 PCR鉴定菌落含阳性重组克隆菌

2.2 融合蛋白GST-FMRP的表达

pGEX-FMR1 ISO10和pGEX-FMR1 ISO7质粒分别转化BL21(DE3)pLysS宿主菌。FMR1 ISO7为1 836bp，可编码蛋白约68.9kDa;FMR1 ISO10大小为 1 640bp，可编码蛋白大小约 48.7kDa。含pGEX-FMR1 ISO10质粒的宿主菌经0.5mM IPTG诱导，在约75 kDa处有明显蛋白表达，与预期结果相符(FMRP ISO10为 48.7kDa，GST标签蛋白约26kDa)有文献报道对于FMRP的大肠杆菌重组表达、真核细胞重组表达及体外表达由于产量过低都不够理想［6］。本实验中含pGEX-FMR1 ISO7质粒的宿主菌，经0.5mM IPTG诱导在预期的约95 kDa处(FMRP ISO7为 68.9kDa，GST标签蛋白约26kDa)也没有明显蛋白表达(图3)。

图3 SDS-PAGE分析融合蛋白GST-FMRP ISO10及ISO7的表达差异

2.3 融合蛋白GST-FMRP ISO10的纯化

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B凝胶柱和NLS应用在GST-FMRP ISO10的纯化过程中。10%SDSPAGE和 Western blot检测蛋白纯化产物，SDSPAGE凝胶电泳显示纯化蛋白约为75kDa(图4)，对纯化产物以鼠抗人FMRP单克隆抗体和鼠抗GST单克隆抗体分别进行Western blot检测，结果均呈阳性(图5)。

3 讨论

FXS成因是脆性X智力低下基因1(FMR1)所编码的FMRP的表达降低或缺失。FMR1基因位于X染色体的长臂远端 Xq27.3区的脆性部位，由17个外显子和16个内含子组成，全长约38kb，在哺乳动物间高度保守［7］。FMR1基因5'非翻译区存在一段数目可变的(CGG)n重复序列，其上游250bp处存在一个CpG岛。(CGG)n三核苷酸重复序列的异常扩增、CpG岛的异常甲基化以及基因缺失和基因点突变都可导致FMR1的非正常翻译，引起FMRP表达降低甚至缺失，从而造成临床症状［8，9］。

图4 SDS-PAGE电泳分析亲和纯化产物GST-FMRP ISO10

图5 Western blot分析蛋白纯化产物GST-FMRP ISO10

至今对于FXS已有多种筛查和诊断方法，以PCR技术、细胞遗传学方法和Southern blot方法应用最广，然而每种方法均存在各自的局限性，所以对FXS简易、快速诊断方法的研究仍是热点之一。FXS最终取决于FXS患者各种组织尤其是神经细胞的FMRP表达水平，FMRP的缺失与否可以作为FXS诊断的分子标记，Willemsen等［10］创立的FMRP免疫细胞化学方法—快速抗体检测法检测FMRP水平，比细胞遗传学方法和基因检测方法能更直接反映和解释FXS患者的临床表现［11］。应用抗体法检测FMRP的表达可以筛查出包括FMR1基因内(CGG)n重复序列的不稳定扩增，CpG岛的异常甲基化，以及编码区发生缺失或错义点突变等各种原因所致的FXS。所以开发针对FMRP检测高效、快速、高通量的FXS筛查方法迫在眉睫［12］。但目前国内进行FMRP快速抗体检测所采用的多为进口人FMRP单克隆抗体，还需配备免疫组化染色等相关试剂［4，11］，无完整的试剂盒，不仅价格昂贵，而且由于配套试剂的不统一，可能会影响检测结果的可比性。我们的目标是制备出具有自主知识产权的、特异性高、亲合性强的人FMRP单克隆抗体，在此基础上，辅以全套抗体检测法所需试剂，开发成为FXS检测试剂盒，降低FXS检查成本，简化实验准备，方便使用。

FMR1基因因其复杂的选择性剪接而有多种剪接异构体，理论上人类FMRP剪接异构体至少可能有20种［13］。主要涉及外显子12和14，以及外显子15和17的多个选择性剪接位点［14］。目前，已有5种剪接异构体在不同组织内检测到［15］。FMR1 ISO7与FMR1 ISO1全序列相比，缺少外显子12(共63bp)，全长1 836bp，针对FMRP ISO7的重组表达实验遇到蛋白表达量过低的问题，加入IPTG后宿主菌生长受抑制，OD600检测其菌体浓度低于非诱导对照组。此外，实验中通过改变IPTG诱导浓度(0.125、0.25、0.5、1、2、4 mM)及调整诱导表达温度(25℃及37℃)都不能增加FMRP ISO7的蛋白表达量，无法进行纯化;FMR1 ISO10缺少外显子12和14，全长1 640 bp，由于外显子14包含196bp，所以造成其后阅读框移码，出现翻译提前终止密码子。真核细胞中，无义突变介导的mRNA降解能够选择性地降解含有PTC的mRNA［16］。但本研究在大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS中成功地将FMR1 ISO10在PTC之前序列部分进行重组表达和纯化。FMRP含有两种类型的RNA结合序列:两个KH结构域和一个RGG框［17］。FMRP ISO10含有两个KH结构域，所以制备的抗体可以应用于FXS检测，并且可以弥补FMRP ISO7及ISO1等表达量低的不足。此外，虽然大部分GST融合蛋白是可溶性的，但当有不溶性包涵体存在时，阴离子表面活性剂NLS可起到溶解作用［18］，所以GST促溶标签及NLS的应用解决了蛋白纯化的困难。整套FMRP ISO10的表达纯化系统为FMRP单克隆抗体制备及FXS检测试剂盒的开发奠定了基础，对于FXS筛查，做出早期诊断，防止智力低下人口的出生，提高人口素质有着深远意义。

1 Koukoui SD，Chaudhuri A.Neuroanatomical，molecular genetic，and behavioral correlates of fragile X syndrome ［J］.Brain Res Rev，2007，53(1):27-38.

2 杨芳，白玉杰，李家林.FXS与脆性 X智障蛋白的相关性研究进展［J］.国外医学临床生物化学与检验学分册，2005，26(5):299-301.

3 李东至，廖灿，黄以宁.脆性X综合征的快速PCR筛查［J］.中国优生与遗传杂志，2005，13(2):31 -32.

4 罗序峰，钟建民，张晓珍，等.发根脆性X智力低下蛋白检测法诊断脆性 X综合征［J］.中国当代儿科杂志，2009，11(10):817-820.

5 Tamanini F，Willemsen R，van Unen L，etal.Differentialexpression of FMR1，FXR1 and FXR2 proteins in human brain and testis［J］.Hum Mol Genet，1997，6(8):1315 -1322.

6 Evans TL，Mihailescu MR.Recombinant bacterial expression and purification of human fragile X mental retardation protein isoform 1［J］.Protein Expr Purif，2010，74(2):242 -247.

7 Eichler EE，Richards S，Gibbs RA，et al.Fine structure of the human FMR1 gene［J］.Hum Mol Genet，1993，2(8):1147 -1153.

8 Oostra BA，Willemsen R.A fragile balance:FMR1 expression levels［J］.Hum Mol Genet，2003，(2):R249 -257.

9 D＇Hulst C，Kooy RF.Fragile X syndrome:from molecular genetics to therapy［J］.JMed Genet，2009，46(9):577 -584.

10 Willemsen R，Los F，Mohkamsing S，et al.Rapid antibody test for prenatal diagnosis of fragile X syndrome on amniotic fluid cells:a new appraisal［J］.JMed Genet，1997，34(3):250 -251.

11 钟建民，吴华平，陈勇，等.外周血淋巴细胞FMRP检测在脆性X综合征中的应用［J］.江西医药，2007，42(7):579 -582.

12 Khaniani MS，Kalitsis P，Burgess T，etal.An improved Diagnostic PCR Assay for identification of Cryptic Heterozygosity for CGG Triplet Repeat Alleles in the Fragile X Gene(FMR1)［J］.Mol Cytogenet，2008，1:5.

13 Banerjee P，Schoenfeld BP，Bell AJ，etal.Short- and long-term memory aremodulated by multiple isoforms of the fragile X mental retardation protein［J］.JNeurosci，2010，30(19):6782 -6792.

14 Sittler A，Devys D，Weber C，etal.Alternative splicing of exon 14 determines nuclear or cytoplasmic localisation of fmr1 protein isoforms［J］.Hum Mol Genet，1996，5(1):95 -102.

15 Penagarikano O，Mulle JG，Warren ST.The pathophysiology of fragile x syndrome［J］.Annu Rev Genomics Hum Genet，2007，8:109-129.

16 Nicholson P，Mühlemann O.Cutting the nonsense:the degradation of PTC - containing mRNAs［J］.Biochem Soc Trans，2010，38(6):1615-1620.

17 Shinahara K，Saijo T，Mori K，et al.Single-strand conformation polymorphism analysis of the FMR1 gene in autistic and mentally retarded children in Japan［J］.JMed Invest，2004，51(1 -2):52-58.

18 Frangioni JV，Neel BG.Solubilization and purification of enzymatically active glutathione S - transferase(pGEX)fusion proteins［J］.Anal Biochem，1993，210(1):179 -187.

［责任编辑:王丽娜］