桃小食心虫病原菌—球孢白僵菌TST05菌株生物学特性研究

熊 琦， 朱永敏， 曹天文， 李 捷，薛皎亮＊， 谢映平， 王全亮， 杜仙当

（1．山西大学生命科学学院，太原 030006； 2．山西省农业科学院植物保护研究所，太原 030032；3．山西省襄汾县农业局，襄汾 041500； 4．山西省稷山县林业局，稷山 043200）

桃小食心虫（Car posina sasakii Matsu mura）又名桃蛀果蛾，简称桃小。在日本、韩国和我国北方果园普遍发生，是危害严重的果树食心虫类害虫。它的食性很杂，可为害苹果、枣、梨、桃、杏、山楂等10多种果树的果实［1］。该虫以幼虫钻蛀果实内部，使果实畸形，并在孔道和果核周围残留大量虫粪，使果实丧失商品价值，给果农造成很大的经济损失。以往主要使用化学杀虫剂对其进行防治［2－4］，但易产生农药残留、污染环境、伤害天敌昆虫等问题，推行生物防治技术是发展的趋势。目前桃小食心虫生物防治技术主要包括利用性诱剂、昆虫天敌和病原微生物。球孢白僵菌［Beauveria bassiana（Bals．）Vuill．］是一类广谱性昆虫病原真菌，能防治多种农林害虫，如松毛虫、天牛、玉米螟、小菜蛾、食心虫等等［5－7］。并且球孢白僵菌对温血动物和植物无害、易培养，被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一［8］。我国的白僵菌生产和防治松毛虫的应用是世界上最大的真菌杀虫剂应用项目，每年应用面积50万h m2左右，在持续控制害虫和维持物种多样性方面发挥了重要的作用［9］。只是不同来源的菌株生物学特性及致病力存在一些差异，其致病力主要取决于菌株、害虫虫态以及环境条件等多种因素。而菌株产孢量的高低、孢子萌发的快慢与多少等与毒力有很大的相关性［10］，外界温度、湿度则是影响其毒力的2个最重要的环境因子［11－13］。因此，研究菌株的生物学特性，即培养条件和环境条件对其的影响，对应用该菌株进行生物防治具有重要意义。本试验选择了一株分离自自然罹病桃小食心虫幼虫并对其具有较高致病力的球孢白僵菌TST05菌株，研究了不同培养基、温度、湿度条件对菌落生长、产孢量以及孢子萌发的影响，为开发和应用该菌株作为桃小食心虫的生物防治菌种提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 球孢白僵菌TST05菌株及其孢子悬浮液

球孢白僵菌TST05菌株，为本实验室2009年从采自山西省襄汾县苹果园自然罹病的桃小越冬幼虫上分离并鉴定（该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC 4526）。将在PDA培养基上培养了7 d后的TST05菌株孢子用0．1%吐温－80无菌水溶液洗下，用血球计数板计数后，制备成浓度为1×106孢子／mL的孢子悬浮液。

1．2 不同培养条件对TST05菌株菌落生长和产孢量的影响

1．2．1 培养基

选用5种培养基，分别是Cazpek、PDA、PPDA、SDAY、SMAY。各培养基的配方组成见表1。

表1 培养基的配方组成

吸取制备好的孢子悬浮液5μL分别滴加到Cazpek、PDA、PPDA、SMAY、SDAY平板培养基的中央。待悬浮液被吸收后，将培养皿移至（25±1．5）℃的恒温培养箱中培养。每个处理设5个重复，每隔1 d用十字交叉法测量1次菌落直径，共测定14 d。同时观察不同培养基上菌落生长状况。培养40 h后，在体视显微镜下观察菌落生长状况，确定最初产孢时间。培养14 d后，用直径为5 mm的打孔器在距离培养皿中心相同的位置取菌块，放入小烧杯中，加0．1% 吐温－80的水溶液20 mL，经磁力搅拌器搅拌均匀后，用血球计数板测定孢子数，计算产孢量。

1．2．2 温度

吸取孢子悬浮液5μL，接种到PDA培养基中部。将培养皿分别放置于15、20、25、30、35℃（±1．5℃）的人工气候箱（SPX－250I－C型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产。相对湿度均设为100%±10%）中避光培养。每处理重复5皿，菌落直径和产孢量测定同1．2．1。

1．2．3 湿度

将制备好的培养基分别在相对湿度为30%、50%、70%、80%、90%、100%（±10%）温度均设为（25±1．5）℃的人工气候箱中预先放置2 d后，吸取孢子悬浮液5μL接种到培养基上。将培养皿分别置于不同湿度的人工气候箱中避光培养。每处理重复5皿，菌落直径和产孢量测定方法同1．2．1。

1．3 不同温湿度对TST05菌株孢子萌发的影响

取20μL配好的孢子悬浮营养液（含有0．5%蛋白胨、2% 葡萄糖、0．1%K H2PO4和0．1% 吐温－80），涂在无菌的洁净载玻片上。风干后，将载玻片放于灭菌的培养皿中，置于不同温湿度的人工气候箱中进行培养。

1．3．1 温度

将上述装有载玻片的培养皿分别放置于15、20、25、30、35℃（±1．5℃）的人工气候箱（相对湿度均设为100%±10%）中培养。培养48 h后镜检统计孢子萌发情况。试验中的每个处理均设3个重复，每个重复检查5个视野，每个视野不少于100个孢子。

1．3．2 湿度

将上述装有载玻片的培养皿分别放置于30%、50%、70%、80%、90%、100%（±10%）的人工气候箱（温度均设为25±1．5℃）中培养。检测方法同1．3．1。

1．4 数据处理

利用SPSS软件对不同处理组数据进行统计分析，再以Duncan法对各处理之间进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果

2．1 不同培养条件对TST05菌株菌落生长和产孢量的影响

2．1．1 不同培养基的影响

试验结果（表2）显示，TST05菌株在Cazpek培养基上菌落生长速度最慢，菌落直径为3．82 c m，初始产孢时间为70 h，产孢量只有2．41×107孢子／mL，显著低于其他4种培养基。而在PDA、PPDA、SDAY、SMAY 4种培养基上，TST05菌株的生长情况及产孢量没有显著差异，菌落生长与时间呈较好的线性关系，R2＞0．99。而且试验中也观察到在这4种培养基上生长的菌落厚而致密，孢子非常密集。其中在PDA培养基上的菌落直径虽然不是最大，但是初始产孢时间却较早，产孢量也较多，达到4．50×107孢子／mL。综合考虑成本等因素，以下试验选用PDA培养基。

表2 不同培养基上TST05菌株菌落生长及产孢情况1）

2．1．2 不同温度的影响

如表3所示，TST05菌株的生长适应温度范围较宽。在低温15℃和高温35℃条件下都能生长和产孢，虽然菌落直径、产孢量显著小于在20～30℃时生长的菌落，但产孢量仍达到了1．32×107孢子／mL以上。在20～30℃时都能达到很好的生长和较高的产孢量，菌落生长与时间呈较好的线性关系，其中25℃时斜率最大，表明生长速度最快。在25℃培养时营养生长量最大，菌落直径为4．94 c m，产孢量也最多，达到6．19×107孢子／mL，显著高于20℃和30℃。

表3 不同温度下TST05菌株生长与产孢情况1）

2．1．3 不同湿度的影响

如表4所示，TST05菌株生长和产孢所需的湿度范围也较宽。25℃时，当相对湿度降到30%时，虽然菌落生长较慢，菌落直径为2．81 c m，但产孢量也能达到1．37×107孢子／mL。随着湿度的加大，TST05菌株的菌落直径、生长速度和产孢量都有显著的增加。相对湿度为80%时，菌落直径达到3．58 c m，产孢量为3．75×107孢子／mL。当相对湿度达到100%时，TST05菌株的菌落直径最大、生长速度最快、产孢量也最多，显著高于其他各组。

表4 不同湿度下TST05菌株生长与产孢情况

2．2 不同温湿度对孢子萌发的影响

2．2．1 不同温度的影响

从试验结果（图1）可看出，相对湿度100%时，TST05菌株的孢子在15～35℃条件下都能萌发。但是温度的高低对孢子萌发有显著影响。15℃时的萌发率为52．28%，萌发率随着温度的升高逐渐增加。25℃的萌发率最高，可达到98．49%，显著高于其他温度下孢子萌发率。随着温度的进一步升高，萌发率开始下降。30℃时降到75．23%，35℃时为29．82%，显著低于其他试验温度。由此可见25℃是TST05菌株孢子萌发的最适温度。此菌株孢子耐受低温15℃的能力好于耐受高温35℃的能力。

图1 不同温度对TST05菌株孢子萌发的影响

2．2．2 不同湿度的影响

由图2可看出，25℃时，孢子在30%～100%的相对湿度范围内均能萌发，萌发率随湿度的降低而降低。相对湿度在80%以上时，孢子萌发率能达到90%以上。相对湿度70%时萌发率降为76．43%，50%时孢子萌发率为63．95%。30%时，孢子萌发率为32．12%。因此，TST05菌株孢子萌发的适宜相对湿度在80%以上，最适湿度为100%。

图2 不同湿度对TST05菌株孢子萌发的影响

3 讨论

桃小食心虫是蛀果害虫，整个幼虫生长期都在果实内部，难以用传统的农药喷施方法进行防治。在其生活史中，老熟幼虫于9－10月从果实中钻出，在树干周围1 m以内的表土层中结冬茧越冬，到第2年4－5月，幼虫破茧出土。一些学者［3－4］已探索在地面土层施药对桃小食心虫越冬幼虫进行防治。所以，可通过在土中喷施菌液或拌施菌粉剂的方法，使桃小食心虫越冬幼虫在出入土时体表沾染病菌，发生感染，达到防治的目的。

本试验结果表明该菌株易于培养，营养需求不高，适应性较强。在营养较贫乏的PDA培养基上也能很好地生长，不论是营养生长还是产孢量都与在PPDA、SDAY、SMAY培养基上相仿。这有利于生产应用时降低生产成本。其次不同温湿度试验结果表明该菌株适宜生长的温湿度范围较宽，在相对湿度100%、20～30℃时，或在最适宜的25℃、相对湿度大于80%时，都能得到很好的生长和较高的产孢量。同时在低温15℃、高温35℃、低湿度条件下也能较好的生长和产孢，说明该菌株对温湿度的适应性较强，施用后能在田间不同温湿度下宿存，达到持续控制害虫的作用。另外作为昆虫的病原真菌，孢子的萌发及入侵是感染寄主的首要条件［7，14－15］。TST05菌株的孢子在较宽的温湿度范围内都能萌发。在最适温度25℃时，即使相对湿度降到30%，孢子萌发率也能达到32．12%。较低温度对孢子萌发影响不大，15℃时孢子萌发率能达到52．28%。高温对该菌株孢子的萌发影响较大。35℃时，相对湿度100%时孢子萌发率为29．82%。以往的研究报道桃小食心虫幼虫出土也需要一定的湿度，赵兴敏［16］调查报告显示，湿度变化对桃小食心虫的发生影响十分明显，当空气湿度升高时，虫口发生数量增加。花蕾等［17］研究表明，在室内适宜湿度条件下（维持花盆内5 c m处土温在23～25℃，土壤含水量在13%左右），来自不同寄主桃小食心虫越冬幼虫均有一明显的出土高峰。所以促使桃小幼虫出土的湿度也有利于孢子的萌发。同时我们可以利用自然环境中的短期高湿条件，例如雨前喷施菌剂，或结合果园管理人为创造短期的高湿条件，在施用菌制剂后进行灌溉，保持土壤的短时湿润，就能使足够的孢子得以萌发，达到侵染寄主，提高防治效果的目的。鉴于TST05菌株在低温和低湿条件下能保持较好的生长和孢子萌发，我们认为，该菌株能适应干旱低温条件，可开发应用为防治桃小食心虫的生物制剂。

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