16s r DNA文库法分析番石榴果实蝇共生菌组成

戴 阳， 李志红＊， 柳丽君， 吴佳教， 邓裕亮

（1．中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193； 2．广东检验检疫技术中心，广州 510623；3．西双版纳出入境检验检疫局，景洪 666100）

番石榴果实蝇［Bactrocer a correcta （Bezzi）］隶属于双翅目（Diptera），实蝇科（Tephritidae），寡鬃实蝇亚科（Dacinae），寡鬃实蝇族（Dacini），果实蝇属（Bactr ocer a），是为害水果的一类重要经济实蝇。番石榴果实蝇主要分布在亚洲的印度、巴基斯坦、泰国、尼泊尔、斯里兰卡、缅甸、越南［1］，目前，该虫在我国主要分布在台湾和云南的局部地区［2－3］。2007年5月28日，农业部与国家质量监督检验检疫总局公布《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，将果实蝇属列为检疫性有害生物，而番石榴果实蝇是果实蝇属中的重要种类。

共生菌是存在于昆虫体内特定部位的微生物，可分为初级共生菌和次级共生菌。初级共生菌在宿主体内垂直传递并与宿主协同进化，次级共生菌同时存在垂直传递和水平传递［4］。共生菌通过生物合成为宿主提供必需的氨基酸等营养物质，帮助宿主降解有害物质［5－6］，在进化中趋向同寄主建立共生关系，许多共生菌还存在与宿主协同进化的现象［7－8］。随着动物胃肠道微生态理论的发展，细菌和昆虫宿主间广泛存在的互利互惠关系不断被发现［9］。近年来，国外研究者针对油橄榄实蝇［Bactrocer a oleae（Gmelin）］、地中海实蝇［Cer atitis capitata （Wiedemann）］等多种实蝇的共生菌展开研究。Kounatidis用16s r DNA文库构建技术，通过油橄榄实蝇DNA提取、通用引物的PCR扩增及产物纯化、克隆转化、测序及比对，发现油橄榄实蝇的优势共生菌为醋酸杆菌［10］，Daniela等通过解剖观察，发现地中海实蝇的主要共生菌为聚团肠杆菌［11］，Capuzzo等人利用16s r RNA基因序列研究了油橄榄实蝇的共生菌，发现一种与宿主协同进化的共生菌并将其命名为“Cantidatus Er winia Dacicola”［12］。

本研究采用16s r DNA文库构建技术及克隆测序方法，检测了番石榴果实蝇室内种群共生菌的多样性，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1．1 试验材料及主要生化试剂

1.1.1 试验材料

本研究所用的番石榴果实蝇样品由广东检验检疫技术中心提供，为室内饲养。取雌虫、雄虫各1头用于共生菌16s DNA文库的构建。样品浸存于无水乙醇中，－20℃保存备用。

1．1．2 主要试剂

血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）、10×Taq Buffer（含15 mmol／L Mg Cl2）、2．5 mmol／L d NTPs、2．5 U／μL Taq DNA 聚合酶、D2000 DNA分子量标准、琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自北京天根生化科技公司，p MD19－T载体购自宝生物工程（大连）有限公司，DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，PCR引物由北京奥科生物技术公司合成。

1．2 16s r DNA文库的建立

1．2．1 单头实蝇基因组DNA提取

用无菌水将实蝇样品快速洗净后，采用 “血液／细胞／组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）”提取单头实蝇成虫样品的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测提取质量。

1．2．2 番石榴果实蝇共生菌16s r DNA序列扩增

参考Willam等的研究［13］，引物采用真细菌16S r DNA正向通用引物27 F；反向通用引物1492R．，该对通用引物可以从广泛的真细菌中扩增出16S r DNA片段。50μL PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液5．0μL（含15 mmol／L Mg Cl2），正反向引物（10μmol／L）各1．0μL，d NTPs（各2．5 mmol／L）4．0μL，DNA模板2．5μL，Taq酶1．2 U，加无菌水至50μL；热循环程序为95℃5 min，接着进行35个循环（94℃3 min，55℃30 s，72℃1 min），最后在72℃反应10 min后结束。PCR扩增产物为各种真细菌16s r DNA片段的混合物。

表1 PCR引物信息

1．2．3 扩增产物纯化及克隆

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外凝胶成像仪下将目的条带切下，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化。纯化产物与p MD19－T载体于16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆。

1．2．4 菌落PCR验证

采用菌落PCR验证白色菌落是否为插入了目的片段的阳性克隆。25μL PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液2．5μL（含15 mmol／L MgCl2），正反向引物（10μmol／L）各 0．2μL，d NTP（各2．5 mmol／L）2．0μL，Taq酶0．6U，加无菌水至25μL，挑取单个菌落作为DNA模板加入；热循环程序为：95℃5 min，接着进行38个循环（94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min），最后在72℃反应10 min后结束。PCR产物用1．5%的琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色10 min，紫外成像系统检测。

1．2．5 限制性内切酶分析及测序

限制性内切酶为MspⅠ，反应体系为10μL，包括10×缓冲液1μL，PCR产物9μL，内切酶4 U，加去离子水至10μL，37℃温浴过夜。酶切产物采用2%琼脂糖冰浴电泳分离。

对酶切图谱进行鉴定、比较，将酶切图谱一致的归为同一个分类操作单元OTU（operational taxonomic unit），挑取同一OTU的代表性克隆子送北京奥科公司进行双向测序。将不同反应所获得的序列进行拼接，获得16s r DNA片段序列（约1．5 kb）。将拼接序列进行BLAST比对（http：∥www．ncbi．nl m．nih．gov／BLAST）。

2 结果及分析

2．1 番石榴果实蝇共生菌总DNA的PCR扩增

样品总DNA的PCR扩增见图1，通过PCR扩增获得的条带约为1．5 kb，且无非特异性条带。得到的扩增产物经纯化后用于16s r DNA文库的建立。

图1 番石榴果实蝇共生菌的16s r DNA扩增图谱

2．2 番石榴果实蝇雄虫共生菌及其分析

将酶切图谱进行比较、分组，共获得11个OTU，如图2a所示，每一个类型选取一个代表性序列进行克隆测序并参考Kounatidis等人的方法统计丰度［10］，共 获 得 11 条 16s r DNA 序 列，长 度 为1．5 kb左右。通过BLAST N搜索Gen Bank数据库，选择数据库中相似性最高且至少大于95%的序列（表2）。相似度分别从95%到99%。从表2可以看出，番石榴果实蝇雄虫共生菌包括假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动杆菌属 （Acinetobacter）、寡 养 单 胞 菌 属 （Stenotr ophomonas）、脂环酸芽胞杆菌属（Alicyclobacill us）、黄杆菌 科 （Flavobacteriaceae）、乳 球 菌属 （Lactococcus）、噬酸菌属（Acidovor ax）、Orbus菌属以及柠檬酸杆菌属（Citrobacter）。其中假单胞菌有2种，其他共生菌各1种。在这10个属（科）中，乳球菌属和假单胞菌属占了50%左右，其中乳球菌约为23．6%，假单胞菌约为26．4%。

2．3 番石榴果实蝇雌虫共生菌及其分析

将番石榴果实蝇雌虫共生菌文库中的13个OTU选取代表性序列进行测序，去掉空载体及无效序列，共得13条16s r DNA序列。通过BLAST N搜索GenBank数据库，选择数据库中相似性最高的序列（表3），相似度从91%到99%。从表3可以看出，番石榴实蝇雌虫共生菌属于假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、苍白杆菌属（Ochrobactr um）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、脱硫弧菌属（Desul f ovibrio）、醋杆菌属（Acetobacter）。其中肠杆菌属有5种，醋杆菌属有3种，其他属的细菌各1种。肠杆菌属是优势共生菌，约占33．9%。

图2 共生菌文库中部分克隆子RFLP结果

表2 番石榴果实蝇（雄）广州种群共生菌组成和相对丰度1）

表3 番石榴果实蝇（雌）广州种群共生菌组成和相对丰度

3 讨论

本研究在番石榴果实蝇雄虫中鉴定了11种细菌，隶属于假单胞菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、寡养单胞菌属、脂环酸芽胞杆菌属、黄杆菌科、乳球菌属、噬酸菌属、Orbus菌属以及柠檬酸杆菌属，表明了番石榴果实蝇中存在多种共生菌。番石榴果实蝇雄虫体内丰度较高的假单胞菌在地中海实蝇和油橄榄实蝇中也曾被发现过［10，14］，但并非优势菌。而另外一种丰度较高的乳球菌则未有文献报道。另外，墨西哥实蝇中也曾发现过柠檬酸杆菌［15－16］。

本研究在番石榴果实蝇雌虫中检测到了13种细菌，隶属于假单胞菌属、肠杆菌属、不动杆菌属、丛毛单胞菌属、苍白杆菌属、寡养单胞菌属、脱硫弧菌属、醋杆菌属。其中肠杆菌属和醋酸杆菌为优势共生菌。

研究表明初级共生菌与次级共生菌相比GC含量较低，这有利于基因的快速进化［17］，如尖音库蚊（Culex pipiens）感染的Wol bachia，其16s r DNA序列的GC含量为46．6%［18］，阮永明检测的B型烟粉虱初级共生菌16s r DNA序列，GC含量为48．2%，次级共生菌为54．1%［19］；李正西研究桃蚜初生共生菌，发现其16s r DNA序列GC含量为49．5%，而次生共生菌为55．5%［20］。本研究鉴定的细菌序列中，GC含量最低为51．0%，多数接近自由生活的细菌。据此可以推测本研究鉴定的细菌均为次级共生菌。

肠杆菌科在实蝇共生菌中具有重要地位，Daniela在地中海实蝇中发现了克雷伯氏菌和肠杆菌［11］，绕实蝇属、按实蝇属和果实蝇属中都有肠杆菌存在［12，16，21］。

次级共生菌部分来自于垂直传递，部分来自于不同寄主的水平传递。受环境影响，昆虫的次级共生菌不如初级共生菌稳定，容易发生改变。如肠杆菌科细菌多存在昆虫肠道中，随取食而摄取，随粪便而排出［20］。但这并不能排除与宿主协同进化的共生菌的存在。

本研究在雄虫中发现丰度较高的绿脓假单胞菌和丰度较低的肠杆菌属细菌，而在雌虫中这一结果正好相反。Behar等在地中海实蝇中同样也分离出绿脓假单胞菌P．aer uginosa。该菌具有致病性，能降低宿主昆虫的寿命［14］。肠杆菌科细菌具有拮抗致病菌、降解有毒物质、增加宿主适应性的功能，另外，肠杆菌还能够促进宿主的碳氮代谢循环［22］。假单胞菌和肠杆菌互为消长，这与两类细菌的生理学功能相吻合。食物对昆虫肠道的微生物影响比较复杂，不同的食物可能会影响共生菌的组成［23］。有人认为在野生状态下，昆虫摄取的果实中含有的次生代谢物质会具有一定的杀菌作用，可能会影响肠道共生菌，尤其倾向选择某些有解毒功能的细菌［24］。蟑螂在取食低蛋白、高纤维食物时，前肠的链球菌（Streptococci）和乳杆菌（Lactobacilli）数量减少，高蛋白的食物则导致H2和CO2产量减少以及G＋C细菌增多［25］。因此笔者估计饲养种群与野外种群的共生菌多样性可能存在差异。

目前针对昆虫共生菌的分离鉴定研究方法主要有3种，即传统的分离培养鉴定法、显微观察法和以变性梯度凝胶电泳（PCR－DGGE）和16s r DNA文库构建为主的分子生物学方法。相比传统的微生物学方法，分子生物学方法能全面获得共生菌的信息，而且不受细菌是否可培养的限制。本研究采用的16s r DNA文库构建和测序方法，不仅获得序列信息比PCR－DGGE更为丰富，还能评估各细菌的丰度，且不需要昂贵的仪器设备［26］。

研究结果为探索番石榴果实蝇共生菌的生理功能及其与宿主的协同进化关系提供了基础。在明确共生菌多样性的基础上，结合相关文献报道，选取对番石榴果实蝇入侵起正作用的共生菌开展研究。针对可培养细菌，通过高温或抗生素去除共生菌，然后通过饲喂或显微注射导入，通过生物学试验明确共生菌对寄主的生理功能，可以明确共生菌对番石榴果实蝇的生物学功能，并进一步揭示番石榴果实蝇和共生菌协同、快速入侵的机制。

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