古岭龙保健酒的遗传毒性研究

2012-02-26吴超伟韦杏泉李春篱

中国民族民间医药 2012年10期

吴超伟韦杏泉覃良李春篱

1.广西中医药研究院，广西南宁 530022;2.广西柳州市古岭酒厂，广西柳州 545107; 3.广西产品质量监督检验院，广西南宁 530022

目前人们由于生活节奏快，长期缺少体育锻炼，易疲劳和免疫力低下的亚健康人群有很多。针对以上人群，我们从扶正固本，调节脏腑功能入手，综合调整机体脏腑功能，使精、气、血液生有源，行有力的传统中医药养生保健理论，自主研制了古岭龙保健酒。是根据传统中药组方，结合现代新工艺研究制作的一种药酒，酒体黄色澄明透亮，香味浓郁，醇厚柔和，回味绵长。本品主要成分是绞股蓝、西洋参、党参、大枣、枸杞子、淫羊藿、黄精、龙眼肉、罗汉果等中药，具有调补肝肾，滋脾养肺，补气养血，扶正祛邪等免疫增强和缓解体力疲劳的保健作用。长期使用的实践结果表明，古岭龙酒具有增强免疫功能和抗疲劳等药理作用，且无任何毒副作用的特点。为了评价其饮用的安全性，本品是按照国家保健食品的法规要求，考察其遗传毒性。本实验采用Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验评价不同浓度的古岭龙酒的抗突变作用。现将实验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂古岭龙保健酒 (规格:125mL/瓶、批号:2009121001)，实验前按要求把古岭龙保健酒用水浴浓缩成浓缩液 (比重为1.3，不含乙醇);91%乙醇的酒基(含40%乙醇的酒基经二次蒸馏得到)(均由广西柳州市古岭酒厂提供);环磷酰胺(山西普德药业有限公司，批号: 1106114);敌克松、叠氮钠、2－氨基芴均购自Sigma公司。

1.1.2 实验动物 SPF级昆明种小鼠，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(桂) 2009－0002。实验动物质量合格证号:0001412。实验动物室温度:22～25℃，相对湿度:55～75%。喂颗粒饲料，自由饮水。

1.1.3 实验菌株鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型系列菌株TA97a、TA98、TA100、TA102由广西区疾病预防控制中心提供。菌株经组氨酸依赖性试验、结晶紫抑菌试验、紫外线敏感试验、R因子的鉴定和PAQ1质粒的鉴定，自发回变数和鉴别性致突变物反应均合格。

1.2 方法

1.2.1 Ames试验［1］采用平板掺入法。用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四种菌株进行试验。以多氯联苯诱导的大鼠肝微粒体酶 (S－9)作为体外代谢活化系统。采用平板掺入法，在保温的顶层培养基中依次加入0.1mL试验菌株增菌液、0.1mL受试物溶液和0.5mL S－9混合液 (当需要代谢活化时)，混匀后倒入底层培养基平板上。5个试验剂量分别为5000、1000、200、40、8μg/皿，同时设自发回变对照、溶剂对照和阳性突变剂对照。自发回变对照除不加样品外，其余条件与样品组相同。溶剂对照用纯水替代样品，其余条件与样品组相同。在无菌操作条件下，用灭菌纯水将浓缩液样品分别配成50、10、2、0.4、0.08mg/mL 5个浓度，经0.22μm孔径滤膜过滤除菌后作为受试溶液。每个剂量组的各种菌株均做3个平行皿。在37℃下培养48小时，计数每皿的菌落数。整套试验在相同条件下重复做两次。如果受试物的回变菌落数增加超过自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量－反应关系者，即为诱变试验阳性。

1.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验［2］选体重为25～30g的昆明种小鼠60只，随机分成6组，每组10只，雌雄各半。试验组3个剂量分别设21710、10855、5427.5mg/kg BW，设阴性对照 (纯水)、酒基对照 (15%乙醇)和阳性对照。称取108.55g古岭龙保健酒浓缩液样品，加含91%乙醇的酒基至100mL，混匀，配成1085.5mg/mL浓度溶液，试验液的乙醇终浓度为15%;再用含15%乙醇的酒基溶液将1085.5mg/mL浓度溶液依次对倍稀释成542.75、271.38mg/mL浓度，试验液的乙醇终浓度均为15%。按0.4mL/20g BW的体积给相应剂量组动物灌胃1085.5、542.75、271.38mg/mL浓度，阴性对照组灌给纯水，酒基对照组灌给15%酒基溶液，阳性对照组灌给2mg/mL的环磷酰胺 (cp)溶液 (剂量为40mg/kg BW)。第二次给受试物后6小时颈椎脱臼处死动物，取胸骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞 (PCE)，微核率以含微核的PCE千分计率，同时计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值 (PCE/ NCE)。采用泊松分布均数比较法统计处理。如试验组的微核率比阴性对照组增高，并有明显的剂量－反应关系和统计学意义，即为阳性结果。

1.2.3 小鼠精子畸形试验［3］选体重为25～35g的昆明种雄性小鼠60只，随机分成6组，每组10只。试验组3个剂量分别设21710、10855、5427.5mg/kg BW，设阴性对照(纯水)、酒基对照(15%乙醇)和阳性对照(环磷酰胺)。称取108.55g古岭龙保健酒浓缩液样品，加含91%乙醇的酒基至100mL，混匀，配成1085.5mg/mL浓度溶液，试验液的乙醇终浓度为15%;再用含15%乙醇的酒基溶液将1085.5mg/mL浓度溶液依次对倍稀释成542.75、271.38mg/ mL浓度，试验液的乙醇终浓度均为15%。按0.4mL/20g BW 的体积给相应剂量组动物灌胃 1085.5、542.75、 271.38mg/mL浓度，阴性对照组灌给纯水，酒基对照组灌给15%酒基溶液，阳性对照组灌给2mg/mL的环磷酰胺(cp)溶液 (剂量为40mg/kg BW)。每天灌胃一次，连续5天。末次给样后第30天处死动物，取副睾的精子涂片，甲醇固定，伊红染色。在光学显微镜下，每只动物计数完整精子1000个，计算精子畸形率。

1.2.4 实验数据统计应用SPSS统计软件进行单因素方差分析。在统计分析分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett检验进行多个剂量组与对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对数据进行适当的变量转换，满足方差性检验后，用转换后的数据进行统计;若转换数据仍未达到方差齐要求，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异。

2 结果

2.1 对Ames试验的影响表1、表2结果表明，古岭龙保健酒各剂量组的回变菌落数均未超过自发回变菌落数的两倍，亦无剂量－反应关系，这表明古岭龙酒在试验剂量范围内，S－9对鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型系列菌株TA97a、TA98、TA100、TA102四种试验菌株均无致突变性。

表1 古岭龙保健酒Ames试验结果

2.2 阳性对照 TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9采用2－氨基芴 (剂量为10μg/皿);TA98－S9采用柔毛霉素(剂量为6μg/皿);TA97a－S9、TA102－S9采用敌克松(剂量为50μg/皿);TA100－S9采用叠氮钠 (剂量为1.5μg/皿);TA102+S9采用1，8－二羟基蒽醌 (剂量为50μg/皿)。表2同。

表2 古岭龙保健酒Ames试验结果 (第二次)

2.3 对小鼠骨髓细胞微核试验的影响表3结果表明，古岭龙保健酒各剂量组小鼠的骨髓细胞微核率与酒基对照和阴性对照组比较，差异均无显著性 (P＞0.05)，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较差异有极显著性(P＜0.01)。古岭龙酒对小鼠的骨髓细胞染色体未见损伤。

2.4 对小鼠精子畸形试验的影响表4结果表明，古岭龙保健酒各剂量组对小鼠精子畸形发生率未产生明显改变，样品各剂量组的精子畸形率与酒基对照和阴性对照组比较，差异均无显著性 (P＞0.05)，而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较差异有极显著性 (P＜0.01)，说明该样品无致小鼠精子产生畸变作用。

3 讨论

本项研究执行《食品安全性毒理学评价程序和方法》和 (GB15193－94)。Ames试验从基因水平上反映了遗传物质受损伤情况，微核的产生与染色体断裂及纺锤体受损有关，微核率的大小可间接反映染色体受损情况。本研究结果显示，在无论有无活化系统 (S－9混合液)存在情况下，古岭龙酒对TA97a、TA98、TA100、TA102四种菌株各剂量组的回变菌落数均接近自发突变，与阴性对照组比较无显著性差异，亦无剂量－反应关系。结果提示古岭龙酒在体外Ames试验未发现致突变作用。在试验剂量范围内，未发现对小鼠的骨髓细胞有致突变作用，也未发现对试验小鼠精子产生畸变作用。