营养素介导的PPARa通路对肠道屏障功能影响的研究＊

姜涛 姜峰奇 金日明 朱跃坤 朱安龙 朴大勋

（哈尔滨医科大学附属一院结直肠外科 黑龙江哈尔滨 150001）

肠道屏障功能已成为判断危重患者预后的一个重要指标，对肠道屏障功能的研究已成为当今医学领域研究的一个重要课题 。肠道不仅是消化吸收器官，肠黏膜本身也是一道十分重要的防御屏障［1］。20世纪60年代Ravin等首先提出胃肠道是无明确感染灶患者多器官功能衰竭前发生脓毒症的潜在致病源。20世纪80年代Border等进一步提出肠源脓毒血症（GOS）的概念。临床上死于脓毒症的多器官功能不全综合征（MODS）患者30%找不到感染灶，但经血培养发现血中存在与肠道常驻菌相似的细菌。已有研究证明肠道在全身炎症反应综合征（SIRS）、脓毒症、多器官功能不全综合征的连续发生发展中起重要作用，因此人们认为肠道不仅是MODS的靶器官，更是MODS的启动者［2］。随着人民生活水平的提高及饮食结构的改变，结肠癌比例亦逐渐增多，通过实验分析不同营养素对肠道屏障功能的影响情况全面揭示PPARa通路的形成与肠道屏障功能的内在联系，并且在临床可以解释不同饮食对肠道屏障的影响并给予指导应用。本实验的研究方向目前在国内处于领先，为今后肠道屏障功能研究开辟了一条新的思路。

1 资料和方法

1.1 实验动物 50只哈尔滨医科大学动物实验室培育的wistar雄性大鼠，体重约在124～150g。将50只wistar雄性大鼠在本实验室适应7d（恒温恒湿，标准鼠食喂养）后随机分为三组，对照组、静脉营养组、肠内营养组，每组为13只。实验动物分笼饲养于20±2℃明暗各12h的清洁级动物实验室内，自由饮水与进食3周。

1.2 试剂及仪器 兔抗PPARa抗体（哈尔滨杰恩来舶科技有限公司）、DBA显色试剂盒，乳酸测定试剂盒，PBS，4%甲醛（哈尔滨医科大学），普通饲料，（哈尔滨医科大学动物实验室），高脂肠内营养饲料能全力（纽迪希亚制药无锡有限公司），5%水合氯醛，肝素。

石蜡切片机（Leitz，德国），微量加样器。p 1-20（Eppendorf，德国），微波炉（格兰仕，广东），电热恒温箱（SC-505，浙江），PHS-25型酸度计（上海），BHZ型双筒显微镜（Olympus，日本），数码医学图像分析系统软件，多聚乙烯导管，金属弹簧管，注射泵。

1.3 营养液配制 静脉营养组以50%葡萄糖、10.3% 复方支链氨基酸和20%脂肪乳剂为基本液体，肠内营养组以能全力（每2092KJ溶液含蛋白质Protein 20g，脂肪Fat 19.5g，碳水化合物Carbohydrate61.5g，膳食纤维Fibre7.5g，矿物质 Minerals 2.5g，维生素Vits 150mg）肠内营养制剂为基本液体，加入一定量的50% 葡萄糖，使二组营养液的热量及含氮量符合标准。

1.4 营养输注方法 静脉营养组：将大鼠一侧颈部去毛消毒、解剖，分离出颈内静脉长约10mm，远心端结扎，切一个小口，立即将充满肝素（25U／m L）等渗盐水的多聚乙烯导管置入颈内静脉至上腔静脉，结扎固定，导管经皮下隧道从颈背部引出，外套金属背心弹簧管保护，缝合切口。将大鼠置于代谢笼内，导管与笼外的微量注射泵相连接，大鼠清醒后可在笼内自由活动 。

肠内营养组：能全力。

对照组：普通饲养。

1.5 肠道缺血－再灌注动物模型建立及标本采集5%水合氯醛按2.5m L／kg腹腔内注射麻醉，无菌条件下，腹部正中切口进腹，在腹膜后右肾上方找出肠系膜上动脉，肝素（100U／100g）静脉注射，3min后夹闭肠系膜上动脉，观察2min待肠壁苍白，血搏动消失，放回腹腔。1h后恢复血供，此时肠壁变红润，血管出现搏动，再灌注后取回肠组织作病理学检查。

1.6 普通光镜检测（包括结果判断标准） 距回盲瓣5cm处，切取一段3cm长的回肠，石蜡包埋切片，HE染色。观察肠壁粘膜上皮结构，有无充血、坏死及异常淋巴细胞浸润等。每张切片用半自动图像分析仪随机检测绒毛高度、黏膜厚度、隐窝深度及绒毛表面积测量（绒毛表面积＝2πrh，r为绒毛的半径，h为绒毛的高度），取平均值 。

1.7 免疫组化步骤 ①载玻片防脱片处理。选用APES，捞片后置烤箱60℃60min以使切片紧密粘附。②切片常规脱蜡至水。③热修复抗原。将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（p H6.0），微波炉加热至沸腾后断电，间隔10min后，反复2次。冷却后PBS（p H 7.2～7.6）洗涤2次。④30%H2O21份加蒸馏水10份混合，室温10min灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。⑤滴加5%BSA封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗。⑥滴加适当稀释的一抗（兔IgG，1：50），4℃过夜。PBS（p H7.2～7.6）洗2min×3次。⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃30min。PBS（p H7.2～7.6）洗2min×3次。⑧滴加试剂SABC，37℃25min。PBS（p H7.2～7.6）洗5min×4次。⑨DAB显色：使用DAB显色试剂盒（AR1022）。取1m L蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间5min，蒸馏水洗涤。⑩苏木素轻度复染，蒸馏水洗涤，酒精梯度脱水，二甲苯透明后，中型树胶封片。显微镜观察。○11利用显微摄影器材对染色切片进行拍摄。○12每批染色以PBS溶液代替一抗做空白对照，以排除假阳性结果。用已知阳性切片做为阳性对照，以排除假阴性结果。阳性切片是在预实验中反复染色一些组织切片，它的阳性染色为棕黄色斑块样，阳性表达的部位与抗原理论上应在的位置一致，并且反复染色的切片阳性反应无变化，非特异反应小的组织切片。

1.8 D-乳酸测定 采用改良的酶学分光光度循环D2乳酸法检测（试剂采用Randox公司乳酸测定试剂盒）。

1.9 光镜下根据Chiu肠黏膜损伤评分方法对小肠黏膜损伤进行分级 Chiu分度标准：0度，正常绒毛；Ⅰ度，绒毛顶端下间歇增宽；Ⅱ度，绒毛顶端上皮脱落、破溃；Ⅲ度，绒毛顶端破坏扩展到基底部；Ⅳ度，上皮完全脱落；Ⅴ度，固有膜崩溃，出现溃疡及出血点。

1.10 肠黏膜PPARa蛋白的表达 取末端回肠和结肠组织冰冻切片，采用常规免疫组化SP法染色检测肠黏膜PPARa蛋白的表达。山羊抗小鼠PPARa蛋白抗体1∶200，PBS代替一抗作为阴性对照。使用HPIAS1000高清晰度彩色图文病理报告分析系统，在相同放大倍数下，于各组每张切片中随机选5个视野，光密度法测定每视野相应细胞PPARa蛋白密度，以阳性显色面积占测量窗内百分比作为半定量指标。

1.11 统计学处理 所有数据均采用spss13.0统计软件分析软件进行处理，计量资料采用单因素方差分析。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组观察指标的比较 见表1。

表1 三组观察指标的比较（X±SD）

三组绒毛膜表面积组间比较P＜0.01，有统计学意义。三组D-乳酸组间比较P＜0.01，有统计学意义。三组PPARa蛋白面积组间比较P＜0.01，有统计学意义。

表1显示，肠内营养组绒毛表面积显著高于对照组和静脉营养组，肠内营养组D－乳酸显著低于对照组和静脉营养组，肠内营养组PPARa蛋白表达的面积显著高于对照组和静脉营养组，差别有统计学意义（P＜0.01）。

3 讨 论

肠道屏障由肠上皮细胞层、黏液层、肠道正常菌群、肠道免疫系统、肠－肝轴等组成。具有机械屏障、化学屏障、微生物屏障、免疫屏障等功能。前3种功能属机体固有免疫功能，后者则属机体的适应性免疫范畴。这些功能具有相对特有的结构基础和不同的分子调控机制，同时又通过一定的信号通路有机结合在一起，共同防御肠道内细菌和内毒素易位，以及外来抗原物质对机体的侵袭。造成肠黏膜组织结构损伤的因素很多，诸如炎性肠道疾病、放疗、化疗及某些药物等；而严重创伤、感染、烧伤和休克等应激可使肠黏膜组织缺血、缺氧，肠黏膜结构发生改变，肠黏膜通透性增加致血浆中D-乳酸及肠黏膜中的PPARa蛋白表达改变。

本实验通过对大鼠的缺血再灌注模型建立，观察在光镜下肠黏膜及血浆中D－乳酸水平，肠黏膜的PPARa蛋白表达，结果显示三组绒毛膜表面积组间比较差别有统计学意义（P＜0.01）。肠内营养组黏膜形态明显好于静脉营养组，标明肠内营养对肠屏障功能的保护作用，而静脉营养则易损伤肠道屏障功能（见图1）。因此，可以认为肠内营养对肠道缺血再灌注有更好的保护作用。肠内营养更符合生理要求，进行胃肠内营养时，食物刺激胃肠道相关细胞分泌各种激素参与肠道的适应性变化，激活肠道神经内分泌轴，调节胃、胆、胰腺分泌，促进胃肠蠕动和黏膜生长，促进胃肠正常菌丛的平衡，并对维持肠壁免疫组织及S-Ig A的生成有重要作用。消化道术后患者不仅可耐受早期肠内营养，而且肠内营养还能促进肠蠕动功能的恢复，表现为肛门恢复排气的时间明显提前，个别患者在早期肠内营养后可出现腹胀、呕吐等症状，主要发生在肠内营养的早期。因此，我们体会应该循序渐进，肠内营养量由少到多，速度由慢到快，经1～2d过度到全量。

三组D-乳酸组间比较差别有统计学意义（P＜0.01）。静脉营养组比肠内营养组D－乳酸水平高，所以静脉营养组在应激状态下肠黏膜通透性比肠内营养组的通透性高，导致细菌代谢产物吸收增加。在机体发生严重创伤休克，肠道发生缺血等损伤时，一方面肠道内细菌大量繁殖，发酵产生大量代谢终产物，D-乳酸含量明显增加；另一方面，肠绒毛顶端上皮脱落，肠黏膜通透性增加。两方面作用使得大量D-乳酸进入血循环，在外周血中可见D-乳酸水平升高。故监测血中D－乳酸水平可及时反映肠黏膜损害程度和通透性变化及肠缺血的标记物。建立大鼠肠缺血再灌注模型发现D－乳酸升高水平与小肠黏膜损害程度密切相关。

肠内营养组，PPARa蛋白主要沿肠黏膜上皮细胞膜的顶端分布，表达呈棕褐色线状信号，但与对照组比较，可见部分棕褐色阳性信号有所减弱。而肠外营养组肠黏膜细胞阳性表达数明显减少（见图2）。三组PPARa蛋白面积组间比较差别有统计学意义（P＜0.01）。肠内营养组PPARa蛋白表达面积显著高于静脉营养组。本研究结果显示，肠内营养组的PPARa蛋白表达水平明显高于肠外营养组，电镜下观察也证实肠内营养组大鼠肠道黏膜形态良好、紧密连接完整从而表明高脂肠内营养剂与PPARa蛋白密切相关，并促进肠屏障功能的恢复，反映了肠道屏障的维持与恢复程度，具有可靠的说服力。但其中的具体机制有待进一步研究。

全肠外营养应用于临床后，在很大程度上改善了肠道不能消化吸收营养的问题。遗憾的是长期肠外营养的患者可出现某些并发症，不能供给肠黏膜营养、不能维持肠黏膜屏障尤为其主要缺点。而肠内营养不但有供给营养的作用，且能改善肠黏膜的屏障功能，这是单纯肠外营养所不能比拟的。

综上所述，接受肠内营养组的大鼠，其肠道黏膜上皮细胞形态结构、完整性明显优于肠外营养组，而且与对照组无明显差异，表明经肠道内给予营养素有助于维护应激状态下肠道黏膜结构。肠内营养可能通过维护应激状态下肠黏膜完整性从而减少肠道细菌移位的发生，进而减少内源性感染的发生。提示肠内营养在维持肠道黏膜屏障、改善微生态环境和维护机体细胞免疫功能方面具有积极作用。

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