脾细胞移植诱导大鼠小肠移植微嵌合体形成的实验研究＊

姜涛 姜峰奇 朱跃坤 朱安龙 朴大勋

（哈尔滨医科大学附属一院结直肠外科 黑龙江哈尔滨 150001）

器官移植是针对于终末期器官功能衰竭的一种有效治疗手段，许多新型免疫抑制剂的出现，大大减弱了移植排斥反应，延长了移植物的存活时间及存活率。但存在长期服用抗排斥药物带来的副作用及排斥反应的反复发作，最佳的处理方法是诱导一种持久稳定、无需服用药物的免疫耐受来解决这一难题。通过建立嵌合体诱导免疫耐受是目前解决器官移植的一种有效的尝试。本实验在建立大鼠同种异体节段性小肠移植模型的基础上，采用脾细胞输注移植观察移植大鼠的微嵌合体形成，探讨微嵌合体形成与移植免疫耐受的关系。

1 资料和方法

1.1 实验动物 供体为雄性SD大鼠；受体为雌性Wistar大鼠，均为SPF级，体重220～260g，哈尔滨医科大学动物实验中心提供。

1.2 脾细胞悬液的制备和移植 供体雄性SD大鼠采用1%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉，无菌条件切取脾脏置于10%肝素钠盐水溶液中，将脾脏组织反复剪切后经200目钢网滤过，滤过液加入5m L淋巴细胞分离液，离心15min，吸取中层液体加入1640培养液5m L漂洗1次，再次加入1640培养液5m L，即为脾细胞悬液。

移植前4周将供体SD大鼠的脾细胞悬液1m L（细胞总数为1.5～2.0×107／m L；细胞活力≥95%）经舌静脉输注到受体Wistar大鼠体内。接受脾细胞移植的大鼠出现皮肤红斑，脱毛，腹泻，体重减轻时，判为移植物抗宿主反应［1］。

1.3 实验分组 实验组：供体为雄性SD大鼠12只，受体为接受相应供体SD大鼠脾细胞输注的雌性Wistar大鼠12只。对照组：供体为雄性SD大鼠12只，受体为未处理的雌性Wistar大鼠12只。

1.4 小肠移植 1%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，清洁手术，在双人双目显微镜下由两人完成。我们在Monchik和Russell手术方法的基础上［2］，改进了血管吻合方式，动脉重建采用带供体腹主动脉袖片的肠系膜上动脉和受体腹主动脉端侧缝合；静脉重建采用供体门静脉和受体左肾静脉端端袖套吻合；共行大鼠同种异体节段性异位小肠移植24例。

1.5 PCR检测嵌合体

1.5.1 外周血模板的制备 移植后5d，取受体外周血1m L，分离白细胞后离心去上清，加蛋白酶K及蛋白酶K－氯仿（1∶1）离心，弃上清，自然干燥，TE缓冲液悬浮沉淀，此液体即为提纯的DNA模板。

1.5.2 皮肤组织模板的制备 移植后5d，无菌条件下切取受体大鼠背部皮肤，剪碎加生理盐水离心，取细胞沉淀多少加入适量裂解液消化。上游引物5′-CGT GGA GAG CGC AAG TT-3′，下游引物5′－GTC GCT GTT TCT GCT GTA GTT A-3′。扩增产物5μL与1μL上样缓冲液混匀，在琼脂糖凝胶内电泳并染色，紫外灯下观察在154bp处出现条带即为Y染色体特异性DNA片段，判为微嵌合体阳性。

1.6 病理学判定 分别于移植术后5d、7d对移植肠管连续取材，石蜡包埋、切片，常规染色病理学检查。排斥反应标准判定参照文献［1］：轻度：肠黏膜绒毛轻度畸形，间质仅有少量的炎性细胞浸润；中度：肠绒毛畸形更加明显，黏膜上皮开始有脱落，细胞浸润加重；重度：肠绒毛的结构消失，上皮明显脱落，肠壁变薄并伴有坏死，肠间质有大量炎细胞浸润，血管炎症明显。

2 结 果

2.1 大鼠接受小肠移植后的存活时间 对照组移植后平均存活时间为7.1±1.2d，显著少于实验组的18.4±3.6d（P＜0.05），差异具有统计学意义。

2.2 嵌合体检测结果 对小肠移植术后存活5d的19只受体雌性大鼠外周血及皮肤应用PCR技术检测Y染色体特异性DNA片段。实验组阳性6例，对照组无阳性结果，差异有统计学意义（见图1）。

2.3 移植物病理检查结果 术后第5d，对照组移植物肠黏膜明显畸形，黏膜上皮明显水肿，间质淋巴细胞浸润，表现为中度排斥反应。实验组移植物肠黏膜轻度倒覆，间质少量淋巴细胞浸润，表现为轻度排斥反应。术后第7d，对照组移植物肠黏膜破坏明显，绒毛出现脱落，肠壁变薄坏死，间质大量淋巴细胞浸润，表现为重度排斥反应。实验组移植物黏膜出现轻度倒覆，间质少量淋巴细胞浸润，表现为中度排斥反应。

图1 PCR电泳图

3 讨 论

由于肠道及其系膜含有大量淋巴组织，小肠移植后的免疫反应为双向反应，不仅有器官移植所共有的排斥反应，而且可能出现移植物抗宿主反应（GVHD）。1993年Starzl提出了双向移植排斥理论［2］，认为供体过客细胞在宿主体内长期存在，通过某种方式可诱导免疫耐受而使受体长期存活。临床实践发现肝脏移植排斥反应较弱，因为肝脏的过客细胞含量高，易于形成嵌合体获得免疫耐受。心肾等实质器官中过客细胞量少，不易形成嵌合体，因此排斥反应较强，此外通过肝肾联合移植增加过客细胞数量，可使排斥反应发生率较单纯肾移植患者减低。在此基础上，Starzl等认为移植物形成嵌合体能力的差异是移植物能否被接受及决定排斥反应强弱的基础，微嵌合状态可导致受体对供体器官的移植耐受。国内乔海泉等在胰腺移植的研究中发现胰腺和肝脏联合移植时可减轻胰腺移植的排斥反应，这种联合脏器移植的互惠作用机制可能与微嵌合体形成有关［3］。

从我们的实验结果可以看到经过雄性供体脾细胞输注的大鼠小肠移植的雌性受体出现了Y染色体特异性DNA片段，即形成了微嵌合体（6／9），其检出率明显高于未经输注的受体（0／10）。表明经外周血脾细胞移植可诱导受体微嵌合体的形成。

目前在小肠移植排斥反应的诊断方面，组织病理学切片检查仍是 “金标准”［4］。我们在大鼠小肠移植术后5、7d通过移植肠段取材进行病理组织学观察，发现实验组和对照组均出现了急性排斥反应，但实验组排斥反应程度较对照组轻；而微嵌合体阴性者受体的急性排斥反应程度较微嵌合体形成的受体明显加重，表明微嵌合体形成与受体移植免疫耐受密切相关。

本实验表明：在大鼠异位节段性小肠移植前预先经外周血进行脾细胞输注移植确实可促进大鼠小肠移植受体微嵌合体的形成，嵌合体形成减轻了急性排斥反应，可诱导受体免疫耐受。我们推测其可能的机制与脾细胞中含有大量的未成熟树突状细胞（DC）有关。Qian S等认为未成熟DC细胞表面协同刺激分子B7的表达存在缺陷，影响T细胞信号传导系统，从而导致同种反应性T细胞无功能、清除或诱导凋亡，因而可促进微嵌合体形成［5］。对于脾细胞移植诱导大鼠小肠移植微嵌合体形成和微嵌合体诱导特异性免疫耐受的确切机制有待进一步研究。

［1］ 吴波，周晓军.小肠移植后急性排斥反应的病理诊断标准［J］.肠外与肠内营养，2005，12（6）：378-381.

［2］ Starzl TE，Demetris AJ，et al.Cell migration and chimerism after whole organ transplantation：the basis of graft acceptance［J］.Hepatology，1993，17：1127.

［3］ 乔海泉，朱预，姜洪池，等.胰腺和肝脏在联合移植时互惠作用的观察［J］.中华外科杂志，1997，35，（12）：749-752.

［4］ Asfar S，Zhong R，Grant D.Small bowel transplantation［J］.Surg Clin Noth Am，1994，74：1197-1200.

［5］ Qian S，Demetris AJ，Murase N，et al.The Murine liver allograft transplantation：tolerance and donor cell chimerism［J］.Hepatology，1994，19：916.