CD24mRNA和PDGF-D mRNA在结直肠癌组织中的表达及意义

张双科 任明慧 姜海毅 陈磊 李杨△

（1泰山医学院 山东泰安 271016；2青岛市市立医院 山东青岛市 266011）

结直肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，以41～51岁发病率较高，近年来其发病率逐渐上升。然而其发生发展机制尚未完全明确。研究表明CD24和PDGF-D参与多种肿瘤的发生、发展和转移的过程［1～4］，但关于两者在结直肠中的报道鲜见。为探讨CD24和PDGF-D与结直肠癌发生发展的关系，本实验采用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测结直肠癌组织及其相应的切缘正常组织中CD24mRNA和PDGF-D mRNA的表达水平，并分析它们与结直肠癌临床病理之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 标本取自2010年7月至2011年8月于青岛市市立医院普外科接受手术治疗的54例结直肠癌患者，年龄37～78岁，术前均未接受任何化疗或放疗。标本离体后立即取材，癌组织取自结直肠癌病灶（避开肿瘤中心坏死组织），正常组织取自距结直肠癌病灶边缘＞5cm的切缘正常组织，取材过程严格遵守无菌操作。将所取标本迅速放入已标记的冻存管，置于液氮中备用。所有标本术后均经2位以上病理科资深医师证实。

1.2 试剂与仪器设备 RNAprep pure动物组织总RNA 提取试剂盒（TIANGEN 公司）；Quantscript c DNA第一链合成试剂盒（TIANGEN公司）；2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN 公司）。Allegra 64R高速冷冻离心机（美国BECKMAN）；SW-CJ-1D净化台（苏州净化）；电热恒温水浴锅（上海博讯）；Multigene梯度PCR仪（美国Labnet）；GelDoc2000凝胶成像系统（美国BIORAD）。

1.3 RT-PCR检测 CD24m RNA 和 PDGF-D m RNA

1.3.1 RNA提取与逆转录 RNA提取操作步骤按照TIANGEN RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒的说明书进行。所提取的RNA溶液用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性；并且判断RNA纯度：OD260／OD280读数在1.8-2.1之间为纯度合格。逆转录操作步骤按照TIANGEN Quantscript cDNA第一链合成试剂盒说明书进行逆转录。反应体系总体积为20μL，37℃孵育60min。所得c DNA产物置于冰箱－20℃保存。

1.3.2 引物设计与PCR 根据GeneBank中CD24和PDGF-D的序列，应用Primer Permier 5.0设计引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成（见表1）按照TIANGEN 2×Taq PCR Master Mix说明书，取25μL反应体系：上、下游引物各1μL，模板cDNA 2μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，RNase-free dd H2O 8.5μL。CD24PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸10min。PDGF-D 退 火温 度 为 50℃，β-actin 退 火 温 度 为54℃，其余反应条件与CD24相同。取5μL PCR扩增产物加样于2.0%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳完毕后，用GelDoc 2000凝胶成像系统观察电泳结果，并采集图片。应用Gel-Por analyzer凝胶定量分析软件对条带进行半定量分析。

1.5 统计学分析 应用SPSS17.0统计学软件对所得数据进行分析，数据用表示，结直肠癌组织和切缘正常组织之间的比较以及CD24mRNA和PDGF-DmRNA表达与结直肠癌临床病理之间的关系采用t检验进行分析，CD24mRNA和PDGF－D mRNA在结直肠癌组织表达的相关性采用Spearman进行检验分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 CD24、PDGF-D和β-actin引物表

2 结 果

2.1 CD24mRNA和PDGF-D m RNA在结直肠癌组织及切缘正常组织中的表达 CD24m RNA在结直肠癌组织中的表达水平高于切缘正常组织（P＜0.05），差异有统计学意义。PDGF-D m RNA 在结直肠癌组织中的表达水平高于切缘正常组织（P＜0.05），差异有统计学意义（见表2）。

2.2 CD24mRNA和PDGF-D mRNA在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌临床病理之间的关系PDGF-D mRNA的表达与年龄、肿瘤的分化程度、Dukes分期有关，P＜0.05，差异有统计学意义；与结直肠癌的浸润程度、肿瘤大小因素无关（P＞0.05），差异无统计学意义。CD24m RNA的表达与结直肠癌的浸润程度有关（P＜0.05），差异有统计学意义；与年龄、肿瘤的分化程度、Dukes分期、肿瘤大小等因素无关（P＞0.05），差异无统计学意义（见表3）。

2.3 两者在结直肠癌组织中的相关性 应用Spearman秩相关统计学方法对所得数据进行分析，表明CD24mRNA和PDGF-D mRNA在结直肠癌组织中表达呈正相关（rs＝0.383，P＝0.004），差异有统计学意义。

表2 CD24m RNA和PDGF-D m RNA在结直肠癌组织中的表达（）

表2 CD24m RNA和PDGF-D m RNA在结直肠癌组织中的表达（）

注：＊t＝32.306，P ＝0.000，＃t＝39.792，P ＝0.000

组织 相对表达量CD24mRNA＊ PDGF-D mRNA＃结直肠癌组织（n＝54）0.8322±0.08560.8482±0.0692切缘正常组织（n＝54）0.2065±0.08710.2533±0.0716

表3 CD24mRNA和PDGF-D m RNA在结直肠癌组织中的表达与结直肠癌临床病理因素之间的关系

3 讨 论

CD24是细胞表面的一种糖基化黏蛋白样蛋白，分子量约31000～68000大小，其主要通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）发挥黏附作用，在人类多种恶性肿瘤存在过度表达［5］。近期研究表明，CD24参与多种肿瘤细胞的黏附和侵袭作用。Baumann P等学者发现CD24能增强c-scr激酶的活性，增加黏着复合物的形成，加速FAK和Paxillin的磷酸化，从而增强整合素介导的黏附作用，促进肿瘤的发展［6］。恶性肿瘤的发生发展是多因素、多步骤的过程，Shapira S认为［7］，CD24作为一种潜在的致癌基因，在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的职能作用，其下游或成为肿瘤潜在的治疗靶点。血小板源性生长因子（PDGF）是一种强促有丝分裂剂，属于生长因子家族，可促进成纤维细胞、平滑肌细胞等多种细胞的分裂增殖。作为原癌基因C-sis的表达产物，PDGF参与多种恶性肿瘤的发生发展过程。PDGF-D是PDGF家族中发现的新成员，其基因位于人类染色体11q22.3，由七个外显子组成，其中外显子6和外显子7共同编码血小板源性生长因子结构域［8］。相关研究表明，PDGF-D参与多种恶性肿瘤的侵袭和转移过程。Ustach CV的研究证实PDGF-D与前列腺癌的转移密切相关［9］。Ahmad A的研究表明PDGF-D的过度表达在乳腺癌细胞的侵袭过程中起着重要作用［10］。PDGF-D参与肿瘤的迁移、侵袭和血管的生成等多种生物学行为，Wang Z认为PDGF-D可能成为指导恶性肿瘤医学治疗的指标之一［11］。

本研究检测结直肠癌组织中CD24m RNA和PDGF-D mRNA的表达水平发现，在结直肠癌组织中，CD24m RNA和PDGF-D m RNA的表达水平高于切缘正常组织，表明两者在结直肠癌中呈高表达，与Baumann P［6］，Wang Z［4、11］等学者的研究报道一致。分析两者与结直肠癌临床病理之间的关系时发现，CD24m RNA的表达与结直肠癌的浸润程度呈正相关，提示CD24可能参与结直肠癌的浸润转移。PDGF-D m RNA的表达与肿瘤的分化程度、Dukes分期因素呈正相关，说明PDGF-D可能参与结直肠癌的淋巴结转移，并且与肿瘤的恶性程度有关。Spearman秩相关分析显示CD24mRNA和PDGFD m RNA在结直肠癌组织中表达呈正相关，提示两者可能共同参与结直肠癌的发生发展过程，但在国内外文献中未见相关报道，有待进一步研究。

综上所述，CD24和PDGF-D在结直肠癌组织中均呈高表达，且与结直肠癌的发生发展密切相关，提示两者可能成为结直肠癌早期诊断和评价预后的新指标，并为结直肠癌的靶向治疗提供新思路。

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