顶复门原虫嘌呤代谢研究进展

山 丹，刘 群

（中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193）

顶复门原虫是一类专性细胞内寄生虫，包括疟原虫（Plasmodium）、巴贝斯虫（Babesia）、隐孢子虫（Cryptosporidium）、等孢球虫（Isospora）、艾美耳球虫（Eimeria）、住肉孢子虫（Sarcocystis）和弓形虫（Toxoplasma）等多种重要寄生原虫。虫体入侵宿主细胞主要通过虫体前端的顶复合器分泌的多种蛋白发挥粘附、入侵等功能，而完成入侵、发育和繁殖等生命活动所需能量的重要物质之一是嘌呤。嘌呤是所有生物所必需的物质，是核酸的组成成分，是细胞的能量来源，也是代谢途径的共作用因子或底物。不同种类的寄生虫所需嘌呤的来源不同，或利用从小分子物质从头合成嘌呤，即从头合成途径（De novo synthesis）；或利用宿主的游离碱基和核苷重转化为相应核苷酸，即补救途径（salvage pathway）。

顶复门原虫均丧失了从头合成嘌呤环的能力［1］。它们依赖于捕捉、转运和补救机制从宿主窃取嘌呤，补充自身的核酸储备［2］。这些代谢途径在顶复门原虫体内有序进行，其所寄生的细胞、组织和环境中嘌呤来源的不同很可能反映了不同种寄生虫需求的不同。如弓形虫，即使在营养最丰富的培养基中，虫体也不能在细胞外繁殖。但是，即使在阻碍蛋白合成的宿主细胞或丧失RNA和DNA合成功能的无核细胞内，弓形虫依然能够获取嘌呤，满足胞内增殖的全部需求［3］。本文以研究报道较多的弓形虫、疟原虫和隐孢子虫3种原虫为主要代表，简述顶复门原虫嘌呤代谢的研究进展。

长期以来，捕获、转运和补救嘌呤途径一直被视为寄生虫进化的最大缺陷，而成为防治寄生虫药物的靶标，直接取得了显著成效。基因工程为寄生虫的代谢研究开辟了新的天地。观察敲除或整合核酸代谢相关基因的工程虫株的表现型，观察正常或突变虫株与突变宿主细胞相互作用，为寄生虫的嘌呤代谢研究提供了新思路和新方法。

1 捕获与转运

基于对利什曼原虫和锥虫的大量研究，近来人们逐渐对几种原虫的嘌呤转运能力以及嘌呤转运体有了清晰的认识。转运体即介导分子或离子转运跨过生物膜的物质。核苷和碱基的转运体有两类：一类 为 sodium-dependent concentrative nucleoside transporters（CNT）；一 类 为 non-concentrative equilibrative nucleoside transporters（ENT）。哺乳动物细胞和细菌同时具有CNT和ENT两类转运体，原虫仅有ENT类转运体［4］。

1.1 嘌呤转运体的基因分析 目前，已确定疟原虫基因组编码嘌呤转运体pf NT1，并推测存在其他3个ENT同系物［5－6］。与疟原虫相似，弓形虫基因组编码Tg AT1及3个ENT同系物Tg NT1、Tg NT2和 Tg NT3［7］。

近期研究显示，Tg AT1、Tg NT1和Tg NT3均可在弓形虫速殖子、缓殖子和孢子化卵囊各个阶段表达，而Tg NT2在上述阶段均不表达［8］。Tg AT1和Tg NT3定位于速殖子的浆膜，Tg NT1在胞质内表达，不在弓形虫的任何已知细胞器内表达。除弓形虫转运体Tg AT1和疟原虫pf NT1外，近期发现的ENT其他同系物的功能尚未确定［8］。

1.2 嘌呤转运体及其功能特征 Plagemann（1986）提出了弓形虫嘌呤捕获模型的第一个假说，即弓形虫可从宿主ATP获取原料合成嘌呤，胞外弓形虫能充分利用宿主ATP或AMP的核苷成分合成自身核苷酸［9］。然而，第一个被确定为弓形虫腺苷转运体的是Tg AT1，是一种非离子浓度依赖的低亲和力腺苷转运体。这一体系很可能需要显著高于宿主细胞生理水平的腺苷浓度。后续研究结果也证实，在细胞内的速殖子、纳虫空泡的间隙和纳虫空泡膜均未检测到水解ATP 5′磷酸酶活性，说明弓形虫不具备充分利用宿主细胞核苷酸的能力。

目前，弓形虫的数个嘌呤转运体的功能己相继得到验证。Tg AT1是腺苷、鸟苷和次黄苷的一种低亲和力转运体，可被药物“双嘧达莫（dipyridamole）”阻断，也可被过量的次黄苷、间型毒素和次黄嘌呤所抑制，但不能被过量嘧啶抑制［10］。这一转运体是具嘌呤选择性的广谱转运体。Tg AT2是弓形虫的第2个腺苷转运系统［11］，也是一高亲和力的广谱转运体，暗示这一转运系统是虫体获取多种核苷的有效途径。类似研究确定了第3个转运系统Tg NT1，并证实Tg NT1是目前所发现的第一个具有选择性转运嘌呤碱基功能的转运体。竞争动力学试验结果显示，TgNT1对次黄嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤均具有高亲和力。

细胞外速殖子的胞质膜镶嵌着Tg AT2和TgNT1转运体系统，具有捕获嘌呤碱基的强大能力，甚至能捕获纳虫空泡间隙的低浓度嘌呤碱基和核苷。可能正是这种较强捕获嘌呤的能力使得弓形虫可寄生于几乎所有哺乳动物细胞。由于弓形虫的纳虫空泡膜具有分子筛的功能［12］，所以并未见碱基、核苷和核苷酸渗透或富集在纳虫空泡间隙的报道。

ENT核苷转运体家族由多达11个成员组成，恶性疟原虫的ENT为pf NT1。pf NT1位于寄生虫胞质膜［13］，在各个发育阶段均表达。抑制试验显示pf NT1为嘌呤和嘧啶的广谱转运体，pf NT1既能转运D型核苷，又能转运L型核苷。

迄今没有发现微小隐孢子虫的嘌呤转运体。

2 嘌呤补救途径

对多种顶复门原虫的嘌呤研究均集中在如何利用宿主的嘌呤碱基和核苷作为寄生虫的核苷酸原料。

研究表明，弓形虫不能从头合成嘌呤，因而必须依赖捕获宿主细胞的嘌呤加以利用。弓形虫拥有强大的嘌呤补救能力，或许正是因为如此，弓形虫方可在种类众多的哺乳动物细胞内生存繁殖。相反，在顶复门原虫中微小隐孢子虫拥有的补救机制最为简单，这种能力的退化很可能与其营养丰富且寄生环境的局限相关。恶性疟原虫的补救途径比弓形虫相对较少。然而，疟原虫在红细胞内寄生增殖，它拥有其他顶复门原虫不具备的一条嘌呤补救途径。

2.1 弓形虫的嘌呤补救途径 纳虫空泡间隙的腺苷经质膜的腺苷转运体运送至虫体内，在腺苷激酶（AK）的作用下，生成一磷酸腺苷（AMP）。AMP通过一磷酸腺苷脱氨酶（AMPD）的脱氨作用生成一磷酸次黄苷（IMP），继而脱氢为一磷酸黄苷（XMP），最终合成一磷酸鸟苷。同时，次黄嘌呤核苷可与次黄嘌呤相互转化，在次黄嘌呤黄嘌呤核糖磷酸转移酶（HXGPRT）的作用下生成IMP，进而可完成AMP向GMP的转化。弓形虫可通过上述两条主要途径，即AK途径和HXGPRT途径，利用宿主嘌呤满足自身需求。

AK途径是弓形虫最为重要的补救途径。用大肠杆菌表达系统表达弓形虫的AK蛋白，通过生物化学、动力学和形态学研究，结果均显示寄生虫与哺乳动物AK蛋白存在显著差异，AK蛋白似乎可能成为药物的靶位点［14］。

与恶性疟原虫和微小隐孢子虫不同，弓形虫拥有功能强大的嘌呤补救途径，利用宿主细胞碱基和核苷即可满足自身的需要。这种特性可以很好地解释弓形虫可利用不同的嘌呤来源，寄生于宿主的几乎有核细胞内。

单独敲除寄生虫的AK或HXGPRT基因，突变虫株的生长状况出现细微但可检测到的缺陷。AK基因缺失虫株的生长速率仅为正常虫株的7.6%，而HXGPRT基因缺失虫株的生长速率仅为正常虫株的3.7%［15］。这一结果表明，嘌呤的捕获或许是限制寄生虫生长速率的关键因素。在宿主细胞供给充足腺苷的条件下，AK基因缺失虫株似乎不能以全速正常生长速率生长繁殖。因此，捕获多种宿主的嘌呤碱基或核苷，利用宿主的嘌呤合成自身核苷酸，这两条补救途径同时存在似乎是弓形虫以最大速率生长繁殖所必需的。见图1。

图1 弓形虫嘌呤转运和补救途径模式图

2.2 微小隐孢子虫的嘌呤补救途径 由于没有有效的方法体外培养微小隐孢子虫，获得用于生化试验的纯净虫体也颇为困难，在很大程度上限制了微小隐孢子虫嘌呤补救途径的研究［16］。微小隐孢子虫基因组的发布第一次揭示了其如何利用宿主细胞的嘌呤满足自身需求的机制。

值得注意的是，腺苷是微小隐孢子虫可从小肠等寄生环境或宿主细胞获得的惟一嘌呤来源。与弓形虫和疟原虫相似，微小隐孢子虫基因组编码腺苷转运体家族基因，腺苷转运体可将宿主细胞的腺苷转运至寄生虫胞质内。该寄生虫可通过AK补救途径生成AMP，即利用腺苷合成自身的核苷酸，完全可满足虫体对腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸的需求。

图2 微小隐孢子虫转运和补救途径模式图

与弓形虫嘌呤补救途径的药物靶点不同的是，参与微小隐孢子虫嘌呤补救途径的每一个酶均可能成为潜在的药物靶点［17］。见图2。2.3 恶性疟原虫的嘌呤补救途径 与微小隐孢子虫相比，恶性疟原虫的嘌呤补救途径更多，且各途径间可相互转化，但没有弓形虫的途径多。恶性疟原虫专寄生于红细胞，拥有高度适应于其独特寄生环境的嘌呤补救机制。红细胞是高度分化的细胞，缺乏哺乳动物其他细胞的多种细胞功能，因而对嘌呤的需求很有限。

为满足寄生虫自身对嘌呤的需要，恶性疟原虫似乎能够转运黄嘌呤、次黄嘌呤和鸟嘌呤这3种碱基，以及腺苷、鸟苷和次黄苷这3种核苷［13］。它具有利用上述6种嘌呤来源的完美补救机制，并且这6种嘌呤来源可相互转化。

恶性疟原虫缺乏从腺苷到AMP的直接转化途径，次黄嘌呤成为疟原虫合成嘌呤核苷酸的重要原料。次黄嘌呤是惟一能够完全满足寄生虫对腺嘌呤核苷酸和鸟嘌呤核苷酸需求的嘌呤来源。

2.4 新发现的一条嘌呤补救途径 在顶复门原虫中，只有恶性疟原虫具有“多胺代谢生成物-5′甲基硫嘌呤循环”这一嘌呤补救途径［2］。恶性疟原虫与弓形虫不同，所寄生的红细胞不能合成多胺，必须自身合成所需的多胺。

最近发现恶性疟原虫的腺苷脱氨酶（ADA）具有识别5′甲基硫腺苷（MTA）并催化其向5′甲基硫次黄苷（MTI）转化的新功能。此外，恶性疟原虫的嘌呤核苷激酶（PNP）具有催化MTI向次黄嘌呤转化的特有功能。

恶性疟原虫ADA和PNP的特有酶催化特性构成了从MTA到MTI再到次黄嘌呤的新代谢途径，实现了从多胺到嘌呤的循环。研究表明，单独利用宿主的次黄嘌呤似乎不足以支持疟原虫在体外培养。嘌呤循环途径的中间产物次黄苷、腺苷和黄苷是恶性疟原虫维持正常生长繁殖所必需。体外研究表明，恶性疟原虫ADA和PNP是参与多胺生物合成的关建酶，也是药物的潜在靶位点。见图3。

图3 微小隐孢子虫转运和补救途径模式图

3 展望

随着抗原虫药物的广泛应用，药物的抗药性以及相应的毒副作用严重限制了药物的临床应用，筛选新型药物成为防治原虫病的当务之急。着眼于宿主与寄生虫代谢机制的差异为确定潜在的药物靶点提供了良好的策略。顶复门原虫与其宿主的嘌呤代谢机制的差异之一，是寄生虫缺乏从头生物合成途径，对于某些必需营养物质的需求只能严格依赖于宿主细胞。近年来，应用生物化学和基因组学技术，揭示了弓形虫、疟原虫以及隐孢子虫等顶复门原虫的嘌呤转运和代谢机制，为弥补现存抗原虫药物的不足，治疗顶复门原虫病筛选潜在药物靶点提供了理论依据。

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