萨能奶山羊乳腺组织5-HTR4基因的克隆序列分析与原核表达

江青东

（郑州牧业高等专科学校动物医学系，河南 郑州 450011）

5－羟色胺（5-HT）是一种吲哚衍生物，分子式C10H12N2O。5-HT能与酸作用生成结晶盐，其熔点167℃～168℃。5-HT是调节神经活动的一种重要物质［1－4］。美国辛辛那提大学医学院纳尔逊·霍斯曼等人研究发现，5-羟色胺能降低奶牛的产奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5-HT含量，就可以将产奶量提高15%，这些作用可被5-HTR拮抗剂二甲麦角新 碱 阻 断，提 示是经过 5-HTR 产 生 的［5－7］。目前，针对哺乳动物5-HTR 基因在乳腺组织中的分布尚未报道。

本试验通过牛和鼠在其他组织中的5-HTR4基因序列设计同源性引物采用RT-PCR方法克隆出奶山羊乳腺组织中5-HTR4的基因组全序列，这将对下一步研究特异性针对乳腺中的5-HTR4，通过基因敲除技术，是一种绿色环保药物，来提高哺乳动物的产奶量和养殖户的经济效益奠定理论和技术基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集 取泌乳期奶山羊（购自陕西萨能奶山羊养殖基地）乳腺组织，液氮速冻后保存于－80℃。

1.2 菌株和质粒 p MD19-T 载体、E.coliJM109感受态细胞、质粒p GEX-4T-1，均购自上海生工生物工程技术服务公司，E.coliBL21（Promega公司）。

1.3 试剂 AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、动物 组 织 RNAout、RNase-Inhibitor、Oligo（d T）、Ta KaRa Agarose Gel、DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Marker、TaqDNA聚合酶、TaKaRa保存待测。BamHⅠ、XhoⅠ和IPTG，均购自Ta KaRa宝生物工程（大连）有限公司，T4 DNA连接酶（Promega公司）；蛋白质标准Marker（Sigma公司）。

1.4 克隆与序列分析

1.4.1 引物设计 根据GenBank公布的牛和鼠的5-HTR4基因的cDNA序列，利用Primer 5.0引物设计软件和BLAST鉴定设计克隆引物。上游：5′-GTGGAGAAGGTSGTGCTGCTCACG -3′，下 游：5′-GGTTGTGGTTGAACARGGGACAGTCTG-

3′，预期片段1 293 bp，引物由北京三博远志生物科学技术有限公司合成。

1.4.2 RNA的提取 按照动物组织RNAout试剂盒的说明进行提取乳腺组织总RNA，用0.8%琼脂糖凝胶电泳（130 V，15 min），紫外灯下观察。紫外分光光度计测定OD260和OD280，检测RNA的纯度及含量（图1）。

图1 乳腺组织中总RNA电泳结果

1.4.3 RT-PCR扩增体系 RT体系：模板 RNA 2 μL，5×Buffer 4μL，d NTP Mix 4μL，RNase Inhibitor 0.5μL，Oligo（d T）1μL，AMV 0.5μL，DEPCH2O 6μL，总体积20μL。混匀室温放置10 min，42℃1 h，置－20℃冰箱备用。PCR扩增体系：10×Buffer（Mg2＋）5μL，d NTP Mix 6μL，25 mmol／L MgCl26μL，rTaq0.5μL，上、下游引物各1μL，cDNA 4μL，dd H2O 14μL，总体积50μL。PCR反应程序：95℃变性5 min；95℃10 s，52℃20 s，72℃30 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。取5μL PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶（100 V、30 min）电泳。凝胶照像并检测PCR产物积分光密度值，用各基因与β-actin的比值相对定量转录水平。

1.4.4 PCR产物回收 产物回收根据 UNIQ-10胶回收试剂盒说明书进行。

1.4.5 目的基因的克隆与测序 连接产物转化，碱裂解法提取重组质粒DNA，通过酶切和PCR鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；阳性菌液送上海生工生物工程技术服务公司测序。

1.4.6 序列分析 通过 Blast、Smart及 BioXM2.6和DNAStar软件对序列进行分析。

1.5 原核表达载体p GEX-5-HTR4的构建

1.5.1 引物 根据克隆的序列设计一对表达引物，上游：5′-CGCCCATCGTCGCATCGCATCG-3′，下游：5′-CCGCGTGAGATCACGCTCTCATG-3′，并在引物中引入BamHⅠ／XhoⅠ酶切位点（划线）。

1.5.2 PCR 扩增体系 dd H2O 15.3μL，10×Buffer（Mg2＋）2.5μL，d NTP Mix 3μL，25 mmol／L MgCl21.8μL，P1、P2 各 0.5μL，克隆载体p MD19-T-5-HTR4 1μL，rTaq0.4μL，总体积25 μL。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，59.5℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物纯化按照纯化试剂盒说明书进行。

1.5.3 质粒pGEX-4T-1和纯化后的 PCR产物进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切 纯化回收产物用T4 DNA连接酶进行连接，22℃3 h，然后转化E.coliBL21（DE3）感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB固体培养基中37℃培养过夜。提取重组质粒，并进行PCR和双酶切鉴定，测序由北京三博远志生物科学技术有限公司完成。并将重组质粒命名为p GEX-5-HTR4。

1.6 重组质粒的诱导表达与鉴定 将含重组质粒（pGEX-5-HTR1）的E.coli单 菌 落 和 含 空 载 体（pGEX-4T-1）E.coli单菌落分别接种于含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基，于37℃摇震培养过夜。然后将培养物按1∶100的比例接种于新鲜的含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基，37℃摇震培养至A600＝0.5～0.6时，加入IPTG 35℃诱导9 h，每2 h取出1 m L培养物。离心收集菌体，用20μL PBS重悬菌体，并加入20μL 2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，100℃变性10 min，进行SDS-PAGE，分析目的蛋白表达。

2 结果与分析

2.1 克隆与序列分析

2.1.1 奶山羊5-HTR4基因的克隆序列 克隆奶山羊5-HTR4基因包含一个完整的开放阅读框架（ORF），长为1 293 bp，酸性氨基酸42个，碱性氨基酸81个，蛋白质分子量为：44.89 k Da，等电点：11.972。

2.1.2 奶山羊5-HTR4基因的种属差异分析

DNAStar分析发现，奶山羊5-HTR4基因的ORF与兔 （Z50162）、猪 （NM-001173418）、人 （human-5HT1D）、狗（NM-001003280）和鼠（AK082016）的同源性分别为46.1%、47.2%、78.9%、45.8%及89.8%。Blastp序列比较分析，奶山羊5-HTR4基因氨基酸序列与鼠和人的同源性分别为88%和77%，相似性分别为83%和79%；Smart分析发现，奶山羊5-HTR4基因推测氨基酸序列信号肽与人、鼠5-HTR4基因氨基酸序列信号肽均为1～23aa，Sap B结构域均为49～126aa，结构特征与人、鼠的5-HTR4相一致。

2.2 原核表达载体的鉴定与诱导表达

2.2.1 原核表达载体p GEX-5-HTR2的鉴定 以克隆的序列设计表达引物进行PCR，得到了长度约为1 293 bp的目的片段；重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，切出约4 700 bp和1 293 bp的DNA片段，与理论值相符（图2）。

2.2.2 重组质粒的诱导表达 p GEX-5-HTR4转化的菌株，在约44.89 k Da处出现一条新生蛋白条带，与预期结果一致，而pGEX 4T-1转化的菌株则只在44.89 k Da处有一新生条带，说明5-HTR4基因已在大肠杆菌中成功表达，并与GST形成融合蛋白（图3）。

图2 重组质粒的双酶切鉴定结果

2.2.3 表达产物的可溶性分析 重组表达载体p GEX-5-HTR1宿主菌经IPTG诱导，离心沉淀，用化学和超声方法裂解细菌后，SDS-PAGE凝胶电泳分析，蛋白主要以不溶性包涵体形式存在。

3 讨论

5-HT分布全身，尤其在血小板和肠内更多，脑内主要是在中缝核及延脑中。迄今为止已发现人类5-HTR至少有7大类，这7种类型又可进一步分成若干亚型［8－11］。按照受体转导方式的不同，可分为G蛋白偶联体超家族和配体门控离子通道族两大类。5-HTR4主要分布于基底节及新皮层区，周围组织血管及神经节中也有分布［12］。目前5-HTR激动剂和抑制剂都是用于神经系统的药物，治疗精神疾病［13］。况且没有专门针对5-HTR的药物，将这些化学药物用于奶牛，一是会影响奶牛的健康，最重要的是这些化合物会在奶里残留，进而影响人的健康。

图3 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

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