纳洛酮对小型猪特异性麻醉剂麻醉大鼠大脑皮质C－jun mRNA表达的影响

尹柏双，李小波，石星星，李志强，范宏刚，高 利，王洪斌

（1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.吉林农业科技学院动物医学学院，吉林 吉林 132101）

近年来研究发现，即刻早期原癌基因C－jun可由于刺激等活动而立即转录出C-jun mRNA，翻译为JUN核蛋白，与FOS蛋白结合后被视为在外界刺激－转录偶联的信息传导过程中起着核内第三信使的作用［1］，调节其他靶基因，参与细胞内信号级联放大过程［2］，参与重要脑功能活动的信号转导和调控过程［3］。研究发现硫喷妥钠［4］、异丙酚［5］等麻醉剂对大鼠脑区C-jun表达影响显著。纳洛酮（Naloxon）是人工合成的阿片类受体颉颃剂，对吗啡、芬太尼和卡芬太尼的麻醉有部分颉颃作用［6－7］，对芬太尼和吗啡诱导引起的脑损伤起到保护作用［8］，对药物滥用、酒精成瘾、休克、脑和心脏局部缺血等一些病理学疾病有治疗作用［9］。本实验室以纳洛酮作为主要成分研制合成了小型猪麻醉剂（XFM）的特异性颉颃剂，临床试验表明，研制的颉颃剂对XFM麻醉小型猪及大鼠催醒效果显著，对麻醉动物心、脑、血液生理指标无不良影响［10－12］。本试验利用实时定量PCR方法研究纳洛酮对大鼠大脑皮质C-jun mRNA表达的影响，探讨纳洛酮对XFM催醒的部分机理。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Trizol RNA提取试剂，购自上海闪晶生物技术研究所；反转录试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；SYBR®GreenⅡ，购自宝生物工程（大连）有限公司；纳洛酮，购自美国辉瑞动物保健品有限公司；XFM（东北农业大学兽医外科教研室配制，批号：071221）；Roche light Cycler 2.0定量PCR仪。

1.2 试验动物及分组 SD纯种大鼠，78只，雌雄兼备，体质量220±20 g，12～15周龄。随机分为空白对照组和试验组，试验组被分为XFM对照组、XFM＋纳洛酮组、XFM＋生理盐水组，每组大鼠按采样时间点被随机分成4个亚组。试验动物在同一条件下饲养，试验前将大鼠安置在安静、避强光的环境中饲养24 h以上。XFM对照组大鼠分别腹腔注射XFM（34.62 mg／kg），在翻正反射后10、20、40、60 min设为4个亚组。XFM＋纳洛酮组、XFM＋生理盐水组大鼠，先腹腔注射XFM，待翻正反射出现时即刻分别腹腔注射纳洛酮（0.15 mg／kg）和等量生理盐水，分别在第2次给药后10、20、40、60 min设为4个亚组。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank中大鼠C－jun mRNA序列（NM021835.3）和actin mRNA序列（NM031144.2），应用Primer 5.0软件分别设计一对特异性引物，C-jun基因上游引物为5′-GGCTGTTCATCT GTTTGTCTT-3′，下游引物为5′-GCCGCTCGCCTATTTCC-3′，actin基因上游引物为5′-GGAG ATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物为5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 检测方法

1.4.1 脑组织中总RNA提取与鉴定 试验大鼠分别在上述4个时间点断头取脑，在生理盐水冰面上迅速分离大脑皮质，称重后剪碎放入玻璃研磨器中，参照Trizol一步法操作步骤提取总RNA。利用紫外分光光度计测定总RNA在260 nm和280 nm波长下的光密度，计算 OD260／OD280比值，分析RNA纯度。提取总RNA后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定提取的总RNA完整性。

1.4.2 逆转录合成cDNA第一条链 以Oligo（d T）18为逆转录引物，提取的总RNA为模板，在反转录酶作用下，合成与mRNA互补的单链cDNA。反应体系及反应条件建立参照全式金反转录试剂盒说明书（编号：AT301）。

1.4.3 RT-PCR检测大脑皮质 C-jun m RNA 定量反应条件的建立：目的基因和内参基因定量PCR反应体系构建参照SYBR®GreenⅡ试剂盒说明操作。扩增程序（Stage 1：95℃，30 s，20℃／s，1 Cycle；Stage 2：95℃，5 s，20℃／s，45 Cycles；Stage 3：95℃，0 s，20℃／s，65℃，15 s，20℃／s，95℃，0 s，0.2℃／s）按照引物特性设计。

标准曲线反应体系建立：随机取一管c DNA，然后用双蒸水按100、101、102、103、104梯度稀释，对应的管家拷贝数分别为：107／m L、106／m L、105／m L、104／m L、103／m L，然后各取2μL进行 RT-PCR反应，扩增程序同上。以起始模板数的对数为y轴，循环数为x轴做回归，建立标准曲线。

1.5 统计分析 试验数据采用相对定量2－ΔΔCt表示，结果以均数±标准差（±S）表示，用SPSS 13.0数据统计分析软件对试验数据进行统计分析，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 提取大脑皮质总RNA质量鉴定结果 提取的总RNA经紫外分光光度计检测，其OD260／OD280＝1.87，说明提取的RNA有较好的纯度。琼脂糖凝胶电泳结果表明，提取的RNA完整性较好（见图1）。

图1 RNA电泳结果

2.2 目的基因RT-PCR溶解曲线结果 SYBR®GreenⅡRT-PCR后进行溶解曲线分析，结果见图2。C-jun m RNA产物的熔解温度为89.5℃，只有一个特异性峰，无引物二聚体和非特异性产物形成，说明所设计引物有很好的特异性，PCR反应条件得到了较好优化。

2.3 目的基因RT-PCR标准曲线结果 按照1.4.3试验步骤进行定量扩增，检测结果以起始模板数的对数为y轴，循环数为x轴做回归，建立标准曲线。回归方程为Y＝ －3.845X＋29.734，R2＝0.9998（见图3）。标准曲线回归相关系数较高，起始模板浓度与循环数（Ct值）之间呈良好的线性关系（见图4）。

2.4 纳洛酮对大鼠大脑皮质C－jun m RNA表达的影响 结果见表1所示。大鼠腹腔注射XFM后引起大脑皮质C－jun mRNA高效表达，各时期C－jun m RNA表达与空白对照组比较差异极显著（P＜0.01）；纳洛酮注射后引起XFM麻醉大鼠大脑皮质C-jun mRNA表达量减少，与XFM对照组比较差异极显著（P＜0.01）；XFM麻醉大鼠腹腔注射生理盐水后各时期C-jun mRNA表达与XFM对照组比较无显著差异（P＞0.05），表明第2次注射刺激对大鼠麻醉后C-jun mRNA表达无显著影响，证明了纳洛酮对C－jun mRNA表达的影响与第2次注射刺激无关，完全是纳洛酮作用引起的。

表1 纳洛酮对大鼠大脑皮质C－jun mRNA表达的影响±S，n＝6）

＃＃：表示XFM组与空白对照组比较差异极显著（P＜0.01）；＊＊：表示药物组与XFM对照组比较差异极显著（P＜0.01）

3 讨论

尽管脂质学说及蛋白学说是以前全麻机理研究的主要内容，但两种学说不足以揭示全麻机理，结合目前麻醉学基因研究方面的进展，提出基因学说并对其进行深入的研究有助于揭示全麻与催醒的机理。C-jun是原癌基因家族成员之一，在中枢神经网络上，刺激等活动迅速引起C-jun基因的一过性表达，翻译为JUN核蛋白，与FOS蛋白结合后返回核内对其他靶基因转录进行调节［13］。C-jun基因作为麻醉相关基因被广泛研究，近来研究发现，硫喷妥钠能引起中枢神经元多个核团jun蛋白的明显表达，推论这些核团可能是全麻药物中枢作用点［4］；许霁虹［14］等试验发现，异丙酚能降低应激大鼠大脑皮质 C-jun m RNA 和c-fos m RNA 表达水平。

C－jun基因表达适用于神经系统功能活动的定位研究，可以检测麻醉药在中枢神经系统的作用部位［15］。但C－jun基因的表达易受其他非试验因素的干扰，为排除干扰性刺激对试验结果的影响，本试验采取以下措施：（1）大鼠于试验前放置在安静、温暖和避强光的饲养环境内48 h以上。（2）在试验操作时力求轻柔，尽量保持大鼠基础状态的稳定。（3）本试验设置严格的XFM对照组，对照组动物与试验组除缺少第二次给药刺激因素不同外，其他条件均完全相同。（4）试验设立了XFM＋生理盐水组，通过试验结果判断第二次注射刺激是否引起cfos mRNA表达，以排除针刺注射对药物作用的影响。（5）所有的大鼠，从取材，RNA提取，鉴定，反转录，再到实时PCR测定的操作等过程均由一个人完成，最大限度的减少试验中的操作误差。

本试验以建立的XFM麻醉大鼠为动物模型，腹腔注射纳洛酮后，研究纳洛酮对大鼠大脑皮质C-jun m RNA表达的影响，探讨纳洛酮催醒XFM麻醉大鼠的部分机理。试验结果表明，纳洛酮注射给药后抑制了XFM诱导大鼠大脑皮质C-jun mRNA表达，颉颃了XFM麻醉剂对大脑皮质的刺激，减少C－jun基因表达，暂时性地阻断了C-jun蛋白作为第三信使传递麻醉信号，而达到催醒作用。

4 结语

研究表明，大脑皮质C-jun基因参与了纳洛酮催醒XFM麻醉作用。纳洛酮抑制XFM诱导大鼠大脑皮质C-jun mRNA表达，阻断XFM麻醉剂引起的中枢信号传递，是纳洛酮催醒XFM麻醉大鼠的重要机理之一。

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