亚硒酸钠对雌鼠生殖系统毒性作用的研究

韩 玉，侯振中

（东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

硒是生物体内必需的一种微量元素，它是谷胱甘肽过氧化物酶活性中心的组成成分［1］。硒作为一种添加剂已经被广泛应用，目前对于补硒及硒对机体的良性作用的研究已经到达一定的深度和广度［2－3］，而对于低毒剂量硒与雌性动物生殖系统的作用关系研究较少。硒的安全剂量和中毒剂量阈值非常小［4］，人们在注重动物补硒的同时，往往控制不好硒的用量，有研究表明，对硒治疗性的摄入也可导致硒中毒［2］，因此补硒不当或略有过量，或长期补硒有可能对生殖系统造成一定毒性作用，对此尚缺乏详细研究。本试验用亚硒酸钠对雌性小鼠按不同剂量灌胃，通过30 d亚急性中毒试验建立雌性小鼠硒中毒的动物模型，探索微量元素硒对雌性小鼠生长发育、生殖系统组织病理学变化、生殖系统组织硒含量和血清谷胱甘肽过氧化物酶等相关参数的影响规律，探讨硒对雌性小鼠生殖系统的毒性作用，为硒的正确使用提供可靠的科学依据，为硒的生殖毒理学研究补充资料。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 将6周龄昆明系雌性小鼠40只，经1周适应性饲养，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组4组，每组10只。

1.2 主要试剂及仪器 亚硒酸钠（化学纯，批号：2009-3-13，上海三浦化工有限公司生产）、DAN（南京建成生物工程研究所）、谷胱甘肽过氧化物酶活性试剂盒（南京建成生物工程研究所），其余试剂均为分析纯。

HH601型恒温水浴锅，LDZ5-2型普通离心机，荧光分光光度计，042296型电子分析天平，常规外科手术器械和电子显微镜。

1.3 小鼠亚急性硒中毒动物模型的建立 急性硒中毒试验测得LD50为10.8 mg／kg。对照组蒸馏水灌胃，3个染硒组分别按0.135 mg／kg（1／80LD50）、0.54 mg／kg（1／20LD50）、2.16 mg／kg（1／5LD50）亚硒酸钠灌胃。4组试鼠均自由采食，自由饮水。连续灌胃30 d。

1.4 检查内容 0 d和第30天对小鼠进行称重测其生长情况，观察其发病情况和死亡状况，计算其蓄积系数 K，K＝LD50（n）／LD50（1）［5］；第30天杀鼠取样，摘取生殖器官（卵巢、子宫）称重，卵巢指数（Ovaries Index，OI）＝卵巢质量／体重（mg／g），子宫指数（U-terus Index，UI）的检测同卵巢指数［6］；电子显微镜下观察卵巢、子宫组织病理学变化；用原子荧光分光光度计测子宫、卵巢组织硒含量；用谷胱甘肽过氧化物酶活性试剂盒检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性。

1.5 统计方法 数据均采用SPSS 17.0软件进行分析，样品均数以平均数±标准误（±S）表示。

2 结果

2.1 小鼠硒中毒动物模型的建立 对照组小鼠在试验期间食欲正常，精神良好，个体增重稳定。染硒组小鼠在试验初期精神良好，第6天时发现部分小鼠皮肤松弛，背毛凌乱，食欲减损；随染硒时间延长，低、中、高组小鼠出现不同程度的精神不振、行动迟缓、背毛凌乱、脱毛、体重下降等情况。试验期间未见小鼠死亡。30 d后剖检可见小鼠肝脏肿大、充血，脾脏肿大、充血，个别小鼠子宫出现炎性肿胀、子宫积液。计算其蓄积系数K＝12，属于弱蓄积性物质。

2.2 亚硒酸钠对雌性小鼠体重增长状况及脏器系数的影响 初始体重差别极小的情况下，整个试验阶段各组小鼠平均体重都随时间在增长，随着染毒剂量增大及时间的延长，平均体重增幅逐渐减小，偶见个别小鼠体重降低或增重停滞现象。

第30天剖检小鼠时发现对照组的卵巢指数与高剂量组差异极显著（P＜0.01），对照组子宫指数与中剂量组差异极显著（P＜0.01），与其他两组差异显著（P＜0.05），随着染毒剂量增加，卵巢指数下降，而子宫指数先升高后降低（见表1）。

表1 小鼠体重状况（g）及卵巢、子宫指数（mg／g）（n＝10）

2.3 卵巢、子宫的组织病理学变化 电镜下观察卵巢超微结构发现，对照组卵巢颗粒细胞内核膜完整，结构清晰，各细胞器完整，未见异常变化；低剂量组颗粒细胞核膜间隙大，核仁有的凝聚成团，部分线粒体空泡变性；中剂量组颗粒细胞变形，出现核膜溶解现象，线粒体数目稀少，内质网肿胀，呈现凋亡细胞的变化；高剂量组颗粒细胞严重变形，核膜皱缩，线粒体肿胀，有空泡形成，凋亡细胞数目增多。观察子宫超微结构发现，对照组子宫腺上皮细胞表面有大量发育良好的微绒毛，细胞核完整规则，各细胞器完整，未见异常；低剂量组子宫腺上皮细胞微绒毛变短，部分细胞出现核仁浓缩，细胞器发育较好；中剂量组子宫腺上皮细胞表面微绒毛稀少，细胞核膜内陷、核仁浓聚，有线粒体肿胀变形，溶酶体明显增多；高剂量组子宫腺上皮细胞微绒毛稀少、短小，核膜深度皱缩，有的消失，仅存核仁和核内的假包含物，线粒体变形。

2.4 雌性小鼠血清GSH-PX及卵巢、子宫硒含量的测定 染毒组血清中谷胱甘肽过氧化物酶的比活力极显著高于对照组（P＜0.01），随染硒剂量呈先升高后降低的趋势。中、高剂量染毒组卵巢硒含量显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），3个染毒组子宫硒含量均显著高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），卵巢、子宫硒含量随染硒剂量的增加而增加，呈剂量效应关系（见表2）。

表2 血清GSH-PX及雌鼠卵巢、子宫硒含量

3 讨论

硒是机体必需的微量元素之一，但高硒作用于机体一定时间即可以产生不同程度的毒性作用，对机体造成危害。胡滨［7］等研究结果表明，毒性剂量硒对小鼠的生长发育有阻滞作用。本试验分别用0.135 mg／kg（1／80LD50）、0.54 mg／kg（1／20LD50）、2.16 mg／kg（1／5LD50）的亚硒酸钠对雌性小鼠灌胃30 d。第20天时染硒组小鼠即出现毛发凌乱、脱毛、皮肤松弛、精神不振等症状。第30天时染硒组小鼠出现行动迟缓、食欲不振等症状，个别小鼠出现神经症状和体重下降等现象。染硒期间未见小鼠死亡。染硒组体重增幅比对照组低。随着染硒剂量增加，卵巢指数逐渐下降，而子宫指数先下降后升高，可能由于高硒作用于生殖系统，阻碍卵巢生长，导致卵巢发育不良，而子宫发生炎性肿胀导致指数升高。电镜下超微结构观察显示，染硒组小鼠子宫、卵巢的细胞出现不同程度的核仁浓缩、内质网出现空泡变性、线粒体肿胀变形、凋亡细胞数目增多等情况，说明0.135 mg／kg（1／80LD50）浓度的硒已经对小鼠造成了生殖系统的损害，成功建立了亚急性中毒小鼠模型。

硒是动物体内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的结构成分之一，因此谷胱甘肽过氧化物酶也是衡量机体内硒含量的一个重要指标［8］。但GSH-PX活性并不会随硒水平升高而无限升高［9］。叶远森［10］等测定高硒绵羊全血GSH-PX活性，发现给硒后20～30 d明显升高，40 d达到顶峰，动物中毒后，GSH-PX活性开始明显下降。刘明宝［11］研究报告表明，大鼠全血GSH-PX活性与饲料硒水平呈线性增长趋势（r＝0.888，P＜0.05），大约反应开始60 d时，血GSH-PX活性维持最高增长，之后则下降。徐辉碧等［12］人研究表示，机体内硒的生物效应、ROS的含量与硒浓度三者呈倒置Weinberg曲线型，高硒浓度范围内硒生物效应表现为毒性作用。本试验表明，随着给硒剂量升高，子宫、卵巢组织内硒含量也随之升高，呈剂量效应关系。而染硒组GSH-PX活力整体水平极显著高于对照组（P＜0.1），在给药剂量为0.135mg／kg时达最高点，之后随给硒剂量升高而逐渐下降。说明当体内硒到达一定浓度以后，并不与GSH-PX完全结合，还可能由于给硒浓度过高，细胞膜结构与功能遭到破坏，高硒可能使蛋白质过度氧化而使酶失去生物学活性。有研究表明，在缺硒状态下GSH-PX活力可以作为衡量机体硒水平的标准［13］，但在本试验中，可得出高硒状态下GSH-PX活力与给硒剂量具有明显负相关趋势，但因给硒剂量分组少，尚不能确实建立相互间的完整相关性，需进一步研究。

综上所述，高剂量硒会阻滞雌性小鼠的生长发育，作用于生殖系统造成一定的毒性作用，对其有弱蓄积作用并呈剂量效应关系，其蓄积系数K＞5，属于弱蓄积性物质。因此补硒时要严格控制用量，不能添加过多，否则会对动物机体带来损害。用谷胱甘肽过氧化物酶作为衡量硒的标准这一问题仍有待研究。

［1］荀黎红，吴从雅.高硒与疾病关系的研究进展［J］.国外医学：医学地理分册，2005，26（3）：106-108.

［2］Wasowicz W，Gromadzinska J，Rydzynski K，etal.Selenium status of low selenium area residents：polish experience［J］.Toxicol Lett，2003，137：95-101.

［3］Ellis D R，Salt D E.Selenium and human health［J］.Cur Opin Plant Biol，2003，6：273-279.

［4］Darlow Brian A，Winterbourn Christine C，Inder Terrie E，et al.The effect of selenium supplementation on outcome in very low birth weight infants：A randonvzed controlled trial［J］.The Journal of Pediatrics，2000，136（4）：473-480.

［5］郭慕陈，冯兆良.关于蓄积系数应用的商榷［J］.中国医科大学学报，1987（6）：45-46.

［6］Hemingway R G.The Influence of Dietary Intake and Supple mentation with Selenium and Vitamin E on Reproduction Diseases and Reproduction Efficiency in Cattle and Sheep［J］.Veterinary Research Communication，2003，27（2）：159-174.

［7］胡滨，陈一资，辜雪冬.亚硒酸钠的急性和蓄积毒性试验研究［J］.现代食品科技，2010，26（10）：1043-1080.

［8］朱善良.硒的生物学作用及其研究进展［J］.生物学通报，2004，39（6）：6-8.

［9］黄克和，王小龙，陈振旅.乳牛的血硒水平及其与谷胱甘肽过氧化物酶活性的关系［J］.南京农业大学学报，1989，12（1）：95-99.

［10］叶远森，李学勤，刘明克.绵羊试验性硒过多症的研究［J］.兽医大学学报，1987，7（3）：62-65.

［11］刘明宝.不同硒水平对猪和大鼠的生长性能、组织硒含量、血GSH-Px活性的影响及比较［J］.兽医大学学报，1989，9（1）：31-35.

［12］徐辉碧，杨祥良，刘琼，等.硒的生物效应的两面性［C］／／中国营养学会第七届微量元素营养学术会议论文摘要汇编.苏州：中国营养学会第七届微量元素营养学术会议，2001：16-25.

［13］王海娜，许厚强，张勇，等.有机硒对雄性昆明小鼠繁殖性能影响的研究［J］.中国畜牧兽医，2011，38（4）：140-143.