牛奶及奶粉中三聚氰胺残留酶联免疫检测方法的研究

张建勋，王战辉，王亚辉，吴小平，李建成，王照鹏，江海洋，沈建忠

（1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.辽宁省畜牧兽医局，辽宁 沈阳 110001；3.北京维德维康生物技术有限公司，北京 海淀 100085）

三聚氰胺（Melamine，MEL）是典型的三嗪类化合物，分子式为C3H6N6，主要用于生产三聚氰胺甲醛树脂。目前食品和饲料工业蛋白质含量测试大多采用测定总氮的方法，因三聚氰胺含氮量高达66%左右［1］，故而常被非法添加至食品和饲料中以提高蛋白质含量指标，给消费者健康带来危害。

目前，关于检测食品及饲料中三聚氰胺的残留的方法，国内外已有很多报道，其中包括高效液相色谱 法 （HPLC）［2］、高 效 液 相 色 谱－串 联 质 谱 法（HPLC-MS／MS）［3－4］、气相色谱－质谱法（GC-MS）［5］等。这些方法虽能准确检测，但都需要大型仪器，样品前处理步骤复杂、耗时，因此，建立灵敏、准确、快速的检测方法是非常必要的。

本试验通过制备三聚氰胺抗原、抗体，建立牛奶及奶粉中三聚氰胺快速检测的酶联免疫检测方法，为进一步研制牛奶及奶粉中三聚氰胺快速检测试剂盒奠定基础。

1 材料

1.1 主要试剂 三聚氰胺（Melamine，99.0%），牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），N，N-二环己基碳二亚胺（DCC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，聚乙二醇（PEG），均购 自 Sigma 公 司；4，6-二 氨 基-2-氯-1，3，5-三 嗪（CAAT，98.0%），购自北京易莱西诺生物科技有限公司；对氨基苯丁酸及其他试剂均为分析纯，购自北京化学试剂有限公司；DMEM培养基，HAT，HT培养基，购自Gibco公司。

1.2 主要溶液（0.02 mol／L，p H 值7.2 PBS；包被液（0.05 mol／L，p H 值9.6 碳酸盐缓冲液） 洗涤液（含0.05%吐温20的 PBS）；封闭液（2%包被液）；样品稀释液（Na2HPO4·12H2O 12.48 g，Na H2PO4·2H2O 7.04 g，加水至400 m L）.

1.3 试验动物和融合细胞 BALB／c小鼠，购自北京实验动物研究中心；SP2／0细胞，由农业部兽医诊断中心惠赠。

2 方法

2.1 三聚氰胺免疫原和包被原的合成 称取CAAT 0.430 g悬浮于10 m L无水乙醇中，加入0.5 g对氨基苯丁酸，加入KOH，使其终浓度为85%；反应混合物75℃水浴回流24 h，分别在16 h和19 h的时候，加入0.37 g对氨基苯丁酸和180 mg KOH；产物过滤，减压蒸馏，获得油状物质。产物溶解于30 m L 5%碳酸钠溶液，10 m L二氯甲烷洗涤两次，水相用浓盐酸调p H值至1，收集沉淀，干燥获得三聚氰胺半抗原，命名为p-ABTAAT。

p-ABTAAT溶解于N，N-二甲基甲酰胺，分别加入等摩尔数的DCC和NHS，室温反应12 h，离心，除去沉淀，得到溶液Ⅰ；向溶液Ⅰ中加入溶有100 mg BSA或67 mg OVA的水溶液5 m L，室温反应12 h；反应液用蒸馏水透析5 d，离心分离出上清液，即得到三聚氰胺免疫原或包被原p-ABTAAT-BSA（或p-ABTAAT-OVA）。

2.2 动物免疫 取100μg p-ABTAAT-BSA偶联物，加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，免疫8周龄雌性BALB／c小鼠5只，免疫6次，每次间隔2周。除最后1次免疫为腹腔注射外，其余均为颈背部皮下多点注射。3免后7～10 d，小鼠眼眶采血，采用间接ELISA方法测定血清效价。

2.3 三聚氰胺单克隆抗体的制备

2.3.1 细胞融合 选取血清效价高和抑制效果好的小鼠用作融合。取小鼠脾细胞与SP2／0细胞在PEG2000作用下融合。将融合后细胞悬液加入到铺有饲养细胞的96孔板中，以HAT和HT培养基选择培养。

2.3.2 杂交瘤细胞筛选及克隆化 融合后7～10 d采用间接ELISA方法筛选效价高的阳性细胞，再采用间接竞争ELISA方法检测阳性细胞分泌的抗体是否对三聚氰胺具有特异性。选择OD值较高且克隆数目较少的阳性细胞进行4次亚克隆。

2.3.3 单克隆抗体的生产 取雌性BALB／c小鼠，注射灭菌石蜡油0.5 m L／只，7～15 d腹腔注射阳性克隆杂交瘤细胞0.5×106／m L～1×106／m L／只。10 d后，抽取小鼠腹水。经辛酸－饱和硫酸铵法提纯，分装冻干保存。

2.4 间接竞争ELISA标准曲线的建立 用包被缓冲液将包被抗原p-ABTAAT-OVA稀释为一定浓度，100μL／孔，4℃过夜；倾去孔内液体，用洗涤液洗涤4次，拍干。每孔加入150μL封闭液，37℃恒温封闭1 h，洗涤4次，拍干；将50μL抗体与等体积倍比稀释的三聚氰胺标准液加到酶标板上反应，每孔100μL，37℃反应1 h，洗涤4次，拍干；每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG，37℃反应1 h，洗涤4次，拍干；每孔加入TMB溶液100μL，37℃显色15 min，然后每孔加入50μL 2 mol／L H2SO4以终止反应，最后用酶标仪测定各孔的OD450nm值。

2.5 交叉反应率的测定 采用间接竞争ELISA，将其他药物系列稀释，用交叉反应待测药物代替三聚氰胺。用下式计算各竞争物与三聚氰胺抗体的交叉反应率。

交叉反应率＝［IC50（melamine）／IC50（竞争物）］×100%

2.6 样品处理

2.6.1 牛奶 取100μL加入900μL样品稀释液，充分混匀，取50μL用于检测。

2.6.2 奶粉 称取1.00±0.01 g于50 m L离心管中；加入6 m L蒸馏水充分混匀；取100μL加入900 μL样品稀释液，充分混匀；取50μL用于检测。

2.7 添加回收率的测定 以500μg／L、1 000μg／L和2 000μg／L 3个浓度添加牛奶；以1.0 mg／kg、2.0 mg／kg和3.0 mg／kg 3个浓度添加奶粉。按照2.6所述方法进行提取。

3 结果与分析

3.1 三聚氰胺半抗原的鉴定 经质谱鉴定半抗原结构，发现其分子离子峰为289（M＋1）。半抗原化合物的元素分析结果（%）：C，54.16；H，5.59；N，29.15；O，11.10。由上可知，化合物的分子量为288，分子中含有2个O，13个C。说明三聚氰胺半抗原合成成功。

3.2 杂交瘤细胞株的建立 细胞融合后第7天，取上清液用间接ELISA方法检测。选择阳性中OD值高的，克隆数目较少的孔，经过4次亚克隆，得到1株能稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F9。体内诱生腹水法获得单克隆抗体，腹水效价可达1.5×105。

3.3 三聚氰胺标准曲线的建立 确定包被抗原的最佳稀释浓度为1∶2 000，单克隆抗体的工作浓度为1∶80 000。采用间接竞争ELISA法建立检测三聚氰胺的竞争抑制曲线，此抑制曲线针对三聚氰胺的IC50为61.3 ng／m L。见图1。

图1 三聚氰胺间接竞争ELISA标准曲线

3.4 交叉反应率的测定 该株单抗与三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺、4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪的交叉反应率分别为100.0%、1.3%、1.67%、2.45%、2.75%。见表1。

3.5 添加回收率的测定 以500μg／L、1 000μg／L和2 000μg／L 3个浓度添加牛奶，回收率在76.4%～91.0%，变异系数在2.4%～14.5%；以1.0 mg／kg、2.0 mg／kg和3.0 mg／kg 3个浓度添加奶粉，回收率在68.1%～83.8%，变异系数在3.4%～9.0%。结果见表2。

表1 三聚氰胺单克隆抗体的交叉反应率

表2 牛奶及奶粉中三聚氰胺的添加回收结果

4 讨论

4.1 三聚氰胺人工抗原的制备 免疫半抗原设计的原则是免疫半抗原与载体连接后能最大程度的保持和突出待测物的特征结构［6］。三聚氰胺分子上有3个氨基，它们的反应活性是一样的，若采用戊二醛法或通过卤代羧酸将氨基取代，则很有可能形成一元、二元甚至三元取代的混合物。这样的话，就破坏了三聚氰胺游离氨基的特征结构。因此，选择4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪作为先导化合物，CAAT 上的 Cl原子很容易被对氨基苯丁酸的氨基H原子取代，形成能最大程度保留三聚氰胺特征结构的半抗原。

4.2 三聚氰胺单克隆抗体 根据表1中交叉反应率的测定结果，说明该抗体的特异性较高。同时表明三嗪环上的3个氨基在与抗体识别过程中发挥着重要作用。另外，就4，6-二氨基-2-氯-1，3，5-三嗪的低交叉反应率，可能与其结构上的氯原子的强吸电子效应有关。

4.3 牛奶、奶粉样品的测定 免疫分析方法的样品前处理较为简单，但基质效应对免疫测定有一定影响。Yin［7］等建立间接竞争ELISA方法检测牛奶、奶粉及饲料中三聚氰胺残留时，将牛奶样品10倍稀释后直接测定，奶粉样品经0.02 M醋酸缓冲液沉淀蛋白，上清液10倍稀释后测定。本试验中，对牛奶、奶粉都是直接10倍稀释后上样检测。从对基质效应的分析来看，1∶10倍稀释的样品已基本上消除了生物基质对检测的影响。

该方法快速、灵敏、简便、可靠，完全符合目前对牛奶及奶粉中三聚氰胺快速检测的需求。

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［2］陈婷.高效液相色谱法测定饲料中三聚氰胺［J］.福建畜牧兽医，2007，29（6）：10-13.

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［5］陈义强，王宗义，张丽英，等.气相色谱－质谱法测定鸡蛋中三聚氰胺残留［J］.中国畜牧杂志，2009，5：45.

［6］李俊锁，邱月明，王超.兽药残留分析［M］.上海：上海科学技术出版社，2002：156-170.

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