内毒素对肉鸡肠黏膜及肝线粒体复活体Ⅰ活性的影响及氨基胍的保护效应

王 岩，石冬梅，向瑞平，皇甫和平，张 华，唐兆新，徐家华，王友令，张 胜

（1.郑州牧业工程高等专科学校，河南 郑州 450011；2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

内毒素 （endotoxin）是指革兰阴性细菌细胞壁外膜的脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS）成分［1］。在兽医临床中，由于抗生素或补体复合物的大量使用，使大肠杆菌、沙门菌等革兰阴性菌死亡裂解，释放出内毒素［2］。内毒素脂多糖（LPS）可引起组织缺血，改变溶酶体内过氧化物及线粒体内细胞色素氧化酶系统，消耗大量ATP，使钙泵活性下降，并阻碍呼吸链的传递，介导质子过氧化反应，促进氧自由基的形成，进一步损伤细胞膜结构［3］。内毒素血症是导致革兰阴性杆菌病抗生素治疗失败和家禽业重大经济损失的主要原因之一［4］。因此，阐明其发病机制，寻找有效的防治方法具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物分组与处理 本试验所用岭南黄羽肉鸡，均购自广东省畜牧研究所孵化厂，自由采食和饮水，至30日龄，从中选出个体体重差异不显著的黄羽肉鸡90只，随机分成3组，每组肉鸡随机分成5小组，每小组6只。生理盐水对照组（30只），分别每只翅静脉注射生理盐水2 m L；LPS组（内毒素组）（30只），分别每只翅静脉注射5 mg／kg LPS；AG＋LPS组（氨基胍治疗组）（30只），分别每只翅静脉注射300 mg／kg的AG，1 h后再分别翅静脉注射5 mg／kg LPS。

1.2 样品采集处理与线粒体的提取 各小组分别在处理后1、3、5、7、9 h的5个时间点采样。用苯巴比妥钠翅静脉注射麻醉，剖腹取肝脏和十二指肠黏膜放入样品袋中，标明样品名称和编号，立刻投入液氮中速冻，再置于－80℃的超低温冰箱中保存备用［5］。线粒体分离方法按藏莹安方法提取，置于－80℃超低温冰箱中储存备用［6］。

1.3 线粒体复合体Ⅰ的测定方法 分别取1 mol／m L Tris-HCl 50μL、1.3 mol／m L DCIP 50μL，、双蒸水850μL左右，加入到紫外－可见分光光度计比色皿中（30℃，温浴），再加入15 mmol／L的 NADH 50μL，用移液枪吹打多次，使其充分混匀，同时做一对照比色皿，立刻在600 nm的波长下进行时间扫描，扫描时间为300 s，当扫描45 s后，立刻打开分光光度计比色池的盖子，在样品比色皿中加入10～50μL的线粒体样品，加完后，用移液枪快速吹打几下，立刻盖住盖子继续进行时间扫描，并得到酶动力学曲线［7］。

线粒体复合体Ⅰ活力的计算：复合体Ⅰ活力＝（△A／min sample－△A／min blank）÷21÷（取样量×蛋白含量）

1.4 数据处理 应用SPSS统计分析软件计算各组不同时间平均值和标准误，通过Ducans新复极差检验法（DMRT法）比较各组间的差异。

2 结果与分析

2.1 肠黏膜线粒体复合体Ⅰ活性的测定结果 见图1。

由图1可知，分别用AG＋LPS及LPS处理后，LPS组肉鸡肠黏膜线粒体复合体Ⅰ活性呈现先升高后降低再上升的动态变化曲线，5 h时线粒体复合体Ⅰ活性达到最高，7 h时后线粒体复合体Ⅰ活性下降，9 h时又升高；与生理盐水组相比，各时间点线粒体复合体Ⅰ活性均显著低于生理盐水对照组（P＜0.05）。AG＋LPS组肉鸡肠黏膜线粒体复合体Ⅰ活性呈现先升高后降低的动态变化曲线，3 h时线粒体复合体Ⅰ活性最高，随后逐渐降低；与生理盐水组相比，各时间点线粒体复合体Ⅰ活性均显著低于生理盐水组（P＜0.05）；与LPS组相比，在1、3 h时，线粒体复合体Ⅰ活性均显著高于LPS组（P＜0.05），在5、7 h时，线粒体复合体Ⅰ活性与LPS组之间无显著差异（P＞0.05），直到9 h时，线粒体复合体Ⅰ活性却又显著低于LPS组。

图1 LPS和AG＋LPS对肉鸡肠黏膜线粒体复合体Ⅰ活力的动态变化曲线

2.2 肝脏线粒体复合体Ⅰ活性的测定结果 见图2。

由图2可知，分别用LPS＋AG及LPS处理后，LPS组肉鸡肝脏线粒体复合体Ⅰ活性呈现先升高后降低再上升的动态变化曲线，5 h时肝脏线粒体复合体Ⅰ活性达到最高，7 h时后下降，9 h时又升高；与生理盐水组相比，各时间点肝脏线粒体复合体Ⅰ活性均显著低于生理盐水对照组（P＜0.05）。AG＋LPS组肉鸡肝脏线粒体复合体Ⅰ活性呈现先升高后降低的动态变化曲线，3 h时肝脏线粒体复合体Ⅰ活性最高，随后逐渐降低；与生理盐水组相比，除3 h时肝脏线粒体复合体Ⅰ活性与生理盐水组之间差异不显著 （P＞0.05）外，其余各时间点均显著低于生理盐水组（P＜0.05）；与LPS组相比，在1、3 h时，肝脏线粒体复合体Ⅰ活性均显著高于LPS组（P＜0.05），在5、7 h时，肝脏线粒体复合体Ⅰ活性与LPS组之间无显著差异（P＞0.05），直到9 h时，肝脏线粒体复合体Ⅰ活性却又显著低于LPS组。

图2 LPS和AG＋LPS对肉鸡肝线粒体复合体Ⅰ活力的动态变化曲线

3 讨论

AG对LPS毒害的线粒体复合体Ⅰ活性的作用线粒体是细胞内一个重要的细胞器，是产生能量的场所，其病变影响到细胞各成分的协调并危及细胞生命活动［3］。同时线粒体也是程序化死亡信号转导途径中起关键调节作用的细胞器［8－9］。线粒体复合体Ⅰ是线粒体电子传递链中5个复合体中较为重要的一个，其功能在于催化位于线粒体基质中由三羧酸循环产生的NADH＋H＋中2个H＋经FMN转运到膜间空间，同时再经过Fe-S将2个电子传递到辅酶Q（UQ）。内毒素休克时，细胞能量生成障碍，其原因是线粒体内膜氧化磷酸化功能障碍。研究表明，内毒素作用下6h，幼鼠肠黏膜线粒体肠上皮细胞线粒体不同程度肿胀，嵴不清，空泡样改变明显，微绒毛排列不整、部分断裂、部分紧密连接增宽等病理性损害，证明内毒素对肠黏膜的损伤［10］。大鼠在发生内毒素血症时，肝线粒体质子跨膜能力下降，电子传递链中50%的复合物Ⅰ和Ⅲ的活性降低；肝线粒体偶联程度下降，线粒体内膜电子传递障碍［11］。

本试验研究表明，LPS显著降低了各时间段肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性，这可能是由于LPS诱导机体产生了大量自由基，攻击线粒体膜间的电子传递链，线粒体复合体Ⅰ受损伤，使其活性下降，导致线粒体内膜氧化磷酸化功能障碍，ATP生成减少；到了后期，随着LPS在体内代谢的增加，含量减少，机体内抗氧化能力代偿性回升，自由基生成减少，线粒体复合体Ⅰ的活力也代偿性缓慢回升。注射AG＋LPS 1 h时，肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性未发生变化，3 h时却显著增加了肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性，这是由于AG对LPS具有明显的颉颃作用，使LPS未能充分发挥诱导自由基的作用，从而使线粒体复合体Ⅰ受到损伤程度大大减少，其活性变化减少；5、7 h时，随AG的消耗，肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性趋于正常；9 h时，AG消耗殆尽，肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性显著降低。

4 结论

本试验结果显示，LPS在各时间段显著降低了肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性（P＜0.05）。AG在3 h时却显著增加了肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性（P＜0.05），在9 h时，肉鸡肠黏膜线粒体和肝脏线粒体复合体Ⅰ的活性显著降低（P＜0.05）。结果表明，LPS诱导了线粒体的损伤，引起了能量代谢障碍，ATP生成减少；AG对LPS具有明显的颉颃作用，对机体起到保护作用。

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