黄柏提取物在体外vero细胞中对单纯疱疹病病毒2型的抑制作用

李 涛，彭立新，姜良英

（大庆油田总医院 皮肤科，黑龙江 大庆 163001）

生殖器疱疹［1，2］是我国常见性传播病之一，由单纯疱疹病毒（HSV）感染所引起。目前国内外研究的抗病毒药物已接近50种［3］，以阿昔洛韦（ACV）为代表的核昔类药物成为治疗HSV感染的标准药物和一线用药。

黄柏为芸香科植物黄檗或黄皮树的干燥树皮，黄柏味苦、性寒，能清热燥湿，泻火解毒，消肿祛腐。临床上用于治疗湿热泻痢、黄疸、风疹瘙痒及疮疡后伤口感染属阳证者。近年研究发现黄柏具有免疫抑制、降压、抗癌、抗氧化及抗病毒等新的药理活性。本实验研究旨在了解评价黄柏提取物在体外系统抗单纯疱疹病毒2型的活性，为开发治疗单纯疱疹的新药奠定基础。

1 试验材料

黄柏提取物（西安市天园生物制剂厂）；注射用阿昔洛韦（ACV浙江诚意药业有限公司）；vero细胞（上海细胞生物研究所细胞库）；HSV－2型质控株（sav株）（北京中国药品生物制品检定所）。

2 试验方法

2.1 浓度设置

黄柏提取物粉：在最大无毒浓度下，以溶媒稀释药物，受试终浓度为10、5、2.5、1.25、0.62、0.31 mg／ml 6个浓度。

对照药ACV：以溶媒稀释，受试终浓度为5，2.5，1.25，0.62，0.31，0.15μg／ml 6个浓度。

2.2 HSV接种

Vero细胞以2×105个／ml接种至96孔细胞培养板，每孔0.1 ml，37℃，5%CO2培养，细胞长成单层后进行实验。HSV－2原液分别用细胞维持液依次10倍稀释成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7和10－88个稀释度。

上述各稀释度病毒液分别加入已成单层的Vero细胞培养板，每孔0.1 ml，每稀释度4个复孔，37℃，5%CO2培养，实验设正常细胞对照。24 h后倒置显微镜下观察细胞病变，计算病变细胞占全部细胞的百分率及平均细胞病变百分率。

2.3 病毒毒力测定

0.5 ml病毒悬液分别接种至单层生长的vero细胞中，吸附1 h后去除，充维持液继续培养，至95%以上细胞出现明显病变。吸附病毒的细胞，经反复冻融后收集病毒液作病毒毒力测定。

上述病毒液用培养液顺序10倍稀释后接种至96孔板的单层细胞中吸附，方法同上。在培养20 h和45 h后观察细胞变化情况。每个稀释度重复3孔。以20 h和45 h作为判断时间点，毒性指标判断以及TCID50计算。

2.4 受试物对Vero细胞毒性测定

选择生长良好的单层vero细胞，加上含不同浓度药物的维持液（终浓度分别为20、5、2.5、1.25、0.62 mg／ml），37℃继续培养，逐日观察细胞生长情况，连续4天。以24、48、72、96 h作为判断时间点，计算半数中毒浓度（TC50）。

2.5 药物抗病毒试验

分别将10－2和10－5病毒液按0.1 ml／孔，接种于生长在96孔培养板的单层细胞中。病毒吸附1小时。用含不同浓度受试物或对照药的维持液0.1 ml／孔处理细胞。每个受试浓度设3个复孔，同时设无药对照。继续培养至无药对照孔的细胞病变率＞95%时中止培养。判断时间点为20 h和45 h，计数各孔细胞病变率。以N（正常）／N＋P（病变）×100%计算药物的抑制百分率。

3 监测指标

3.1 毒性指标 细胞病变（CPE）直接镜检，计数病变细胞（P）／正常细胞＋病变细胞（N＋P）的比率，求出P的百分率。

3.2 TCID50计算 病毒半数感染剂量TCID50计算按Reed和Muencl常规法。

3.3 受试物对细胞毒性 计算TC50

3.4 受试物对病毒作用 观察细胞病变（CPE）、计算抑制百分率、IC50。

4 计算方法与统计学方法

通过药物的抑制百分率对药物浓度求直线回归方程，并计算IC50值。

统计学方法：作相关系数的显著性检验。

5 试验结果

病毒毒力测定结果见表1。HSV－2 Sav株病毒TCID50值20 h为2.37；45 h为4.12。药物对vero细胞毒性测定结果见表2。24 h－96 h间细胞对黄柏提取物可耐受的TC50为9.72 mg／ml，TC0为4.36 mg／ml。黄柏提取物和ACV对HSV－2 Sav株致vero细胞病变的抑制作用见表3和表4。在最大无毒浓度下，病毒稀释度分别为10－2和10－5，观察时间分别为20和45 h，黄柏提取物对HSV－2 Sav株致vero细胞病变有抑制作用，IC50值分别为7.89 mg／ml和3.02 mg／ml。

表1 不同时间点HSV－2Sav株对vero细胞的毒力（TCID50）测定

表2 不同时间下黄柏提取物对vero细胞的毒性测定

单纯疱疹病毒Ⅱ型［4］（HSV－2）主要是生殖器疱疹的主要病原体，存在于皮肤和粘膜损害的渗出液、精液、前列腺分泌液、宫颈、阴道分泌液中，主要通过性交传染，引起生殖器感染［5，6］。

黄柏［7］在体外对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌等，均有不同程度的抑制作用。蔡宝昌等［8］选择32种天然药物的热水提取液，对接种了单纯疱疹病毒而引发疱疹的小鼠给药，与阿昔洛韦对照组及空白对照组比较，黄柏给药组可延缓疱疹症状发作或扩散时间，延长小鼠生存时间，并显著降低小鼠的死亡率。

通过我们研究表明：黄柏提取物具良好的抗HSV－2作用。目前临床上治疗HSV感染的系统药物主要为无环鸟苷较为有效，且已被发现有耐药株发生。以本次实验研究为契机，进一步深入研究和探索黄柏提取物的有效成分和药理机制，扩大临床适应症，逐步建立适合于中医药特点的中药药效学评价模式、模型、方法和技术；开展适合中药多成分和复杂作用特点的中药筛选、发现和评价技术研究；在中医药理论指导下开展中药有效成分及其作用机理研究，为开发治疗单纯疱疹的新药奠定基础。

表3 黄柏提取物对HSV－2 Sav株致vero细胞病变的抑制作用（病毒稀释度：10－2，判断时间：20小时）

表4 黄柏提取物对HSV－2 Sav株致vero细胞病变的抑制作用（病毒稀释度：10－5，判断时间：48小时）

［1］郑秀峰.单纯疱疹病毒研究现状［J］.中国麻风皮肤病杂志，2008，24（5）：370.

［2］Johnson RE，Nahmias AJ，Magder LS，et al.A seroepidemiologic survey of the prevalence of herpes simples virus type 2 infection in the United States.Nengl J Med，1989，321（1）：7.

［3］杨占秋.抗病毒药物的临床应用现状［J］.中国医药学杂志，1985（5）：13.

［4］Ashley RL.Genital herpes.Type－specific antibodies for diagnosis and management［J］.Dermatol Clin，1998，16：789.

［5］Johnson RE，Nahmias AJ，Magder LS，et al.A seroepidemiologic survey of the prevalence of herpes simples virus type 2 infection in the United States.Nengl J Med，1989，321（1）：7.

［6］Strans SE，Kost RG，Mckenzier，et al.Immunotherapy of recurrent genital herpes recombinant herpes simplex virus type－2 glycoprotein D and B：Results of a placebo－controlled vaccine trial［J］.J Infect Dis，1997，176（5）：1129.

［7］Chen ML，Xian YF，Ip SP，et al.Chemical and biological differentiation of Cortex Phellodendri Chinensis and Cortex Phellodendri Amurensis.Planta Med.2010 Oct；76（14）：1530－5.Epub 2010 Mar 30

［8］蔡宝昌，潘 扬，吴 皓，等.国外天然药物抗病毒研究简况［J］.国外医学·中药分册，1997，19（3）：48.