和厚朴酚脂质体联合阿霉素抑制4T1细胞增殖的机制研究

张 宇，白海昕，邵永祥，郭庆章，黄 鑫，王 迪，邢立举，翟秀伟

（大庆龙南医院 神经外科，黑龙江 大庆 163453）

和厚朴酚（honokiol）是从传统中药厚朴的根皮、枝皮中提取分离的一种带有烯丙基的联苯二酚类化合物，是厚朴的主要有效成分之一，分子式为C18H18O2。近年研究表明其具有良好的抗肿瘤活性，可以抑制肿瘤新生血管形成，诱导肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞分化，抑制肿瘤转移等作用，其抗肿瘤效应具有多靶点、多效应、毒副作用低的特点，在抗肿瘤治疗中受到了越来越多的关注［1－3］。

因此我们设想和厚朴酚与低剂量常规化疗药物联合可能具有协同抗肿瘤作用，同时可以降低常规化疗药物的毒副作用。鉴于和厚朴酚在水中溶解度很小，且易氧化，传统方法是用二甲亚砜溶解，但二甲亚砜本身具有一定毒性，限制了其临床应用。为提高和厚朴酚的溶解性和稳定性，本实验选择了脂质体来包裹和厚朴酚。

1 材料与方法

1.1 材料

和厚朴酚购自成都思科华生物技术公司，卵磷脂、胆固醇购自成都科龙化工试剂厂，PEG－PE购自天津科密欧化学试剂开发中心，阿霉素、MTT购自Sigma公司，DMEM、胎牛血清等购自Gibco BRL公司。抗cyclin D1多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 空白脂质体的制备 采用薄膜－超声分散法制备。精密称取磷脂／胆固醇／PEG－PE（1∶0.3∶0.08，mol／mol／mol），加入氯仿和甲醇（1∶4，v／v）使其溶解，减压蒸发成薄膜，加入一定量的超纯水使薄膜脱落溶解，超声震荡，即得空白脂质体的混悬液。再将混悬液冷冻干燥成粉便于保存。

1.2.2 和厚朴酚脂质体的制备 采用薄膜－超声分散法制备。精密称取磷脂／胆固醇／PEG－PE（1∶0.3∶0.08，mol／mol／mol），和厚朴酚／总脂类（1∶4，w／w）。加入氯仿和甲醇（1∶4，v／v）使其溶解，减压蒸发成薄膜，加入一定量的超纯水使薄膜脱落溶解，超声震荡1 h，即得和厚朴酚脂质体的混悬液。再将混悬液冷冻干燥成粉便于保存。

1.2.3 脂质体粒径大小的测定 取适量脂质体用超纯水稀释后，用激光粒度仪检测样品的平均粒径。

1.2.4 脂质体包封率的测定 药物的包封率是指被包裹在脂质体囊中的药物占脂质体混悬液中药物总量的比例。本实验采用鱼精蛋白絮凝－离心法分离游离药物与脂质体。脂质体悬液2 000 r／min离心10分钟，沉淀未包封的析晶出来的游离药物，用移液枪精密吸取上层0.1 ml脂质体悬液于1 ml EP管中，加入0.1 ml 10 mg／ml鱼精蛋白溶液，涡旋2 min，静置3 min，在室温条件下离心40 min（13 000 r／min），沉淀脂质体，吸掉上清液，将沉淀用氮气吹干，加入1 ml乙腈超声破乳，离心（12 000 r／min，5 min）。取上清液，流动相稀释后用HPLC法测定峰面积，按标准曲线计算包封于脂质体中的药物量。

其中W总为药物总量，W游为游离药物量。

1.2.5 细胞系及培养 小鼠乳腺癌4T1细胞，由本实验室保存，用含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100μg／ml链霉素的DMEM 完全培养基、5%CO2、37℃培养。

1.2.6 细胞增殖试验（MTT法） 参照文献［4］用完全培养液调整4T1细胞浓度为2×104／ml，接种于96孔板，每孔200μl，培养过夜，次日分别用不同浓度和厚朴酚脂质体、阿霉素、以及和厚朴酚与阿霉素联合处理细胞，对照组不处理，每个剂量组设5个复孔，37℃，5%CO2培养。分别于培养1、2、3、4 d后，取1个培养板，每孔加入5 mg／ml MTT试剂20 μl，继续培养2－4 h，再加DMSO 150μl，振荡混匀15 min，用酶标仪（λ＝570 nm）测定吸光度（A）值（A值与活细胞数成正比），取其平均值。相对细胞增殖率（%）＝实验组A570／对照组A 570×100%。实验至少重复3次。

协同指数（the combination index，CI）的计算公式是：CI＝（D1／Dx1）＋（D2／Dx2），Dx1指单纯和厚朴酚脂质体对细胞抑制率为x%时所需剂量；D1指与阿霉素（剂量为D2）联合对细胞抑制率也为x%时所需剂量。Dx2指单纯阿霉素对细胞抑制率为x%时所需剂量；D2指与和厚朴酚脂质体（剂量为D1）联合对细胞抑制率也为x%时所需阿霉素的剂量。CI＜1.0，两者之间关系为拮抗；CI＝1.0，叠加；CI＞1.0，协同［5］。

1.2.7 流式细胞仪分析 取对数生长期的4T1细胞，按每孔1×105个细胞接种于6孔板中，培养24 h后，加入和厚朴酚脂质体，使其终浓度分别为10 μg／ml、12μg／ml和14μg／ml，并设不加和厚朴酚脂质体的对照组，培养24 h。收集不同处理组和对照组的细胞，用4℃预冷的PBS洗涤3次，加入70%冷乙醇固定细胞，4℃过夜。离心之后加入含RNase的PI染料，半小时后上流式细胞仪检测。

1.2.8 免疫蛋白印记 （Western blot） 分组（同上），细胞加药后12 h，提取细胞总蛋白，用Biorad法进行定量，取20μg蛋白进行10%SDS－PAGE凝胶电泳，电泳结束后转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗3次，室温加入1∶200兔多克隆抗cyclin D1（1∶1000）孵育2 h，TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀释的羊抗兔IgG／AP，室温孵育2 h，TBST洗膜，显色。

1.2.9 统计学处理 实验数据采用均数±标准差表示，利用SPSS11.0软件进行完全随机设计的单因素方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂质体的粒径和包封率

马尔文粒度仪检测得到，空白脂质体的平均粒径为64.7 nm，和厚朴酚脂质体的平均粒径为96.3 nm，粒径分布范围窄且符合正态分布规律。

取三批不同时间制备的和厚朴酚脂质体测定含量分别为：2.984 mg／ml、1.292 mg／ml、1.587 mg／ml，离心后测得游离的和厚朴酚浓度为0.453 mg／ml、0.192 mg／ml、0.196 mg／ml，由公式计算得到平均包封率为84.75%。

2.2 和厚朴酚和阿霉素对4T1细胞生长的抑制作用

由图1A、1B的MTT检测结果显示，空白脂质体组对4T1细胞增殖的影响与阴性对照相比没有明显差异。和厚朴酚脂质体和阿霉素处理细胞48 h的半数抑制浓度（IC50）分别为17.65±0.32μg／ml和0.78±0.08μg／ml。但阿霉素与10μg／ml，12μg／ml和14μg／ml和厚朴酚脂质体联合处理细胞后，阿霉素的IC50分别下降了0.5倍、3倍、15倍（P＜0.05）。由图1C可见两种药物联合应用的协同指数CI＜1，呈协同效应。当和厚朴酚脂质体浓度为14μg／ml，阿霉素浓度为0.2μg／ml时，CI值最低。结果表明低剂量的阿霉素与和厚朴酚脂质体联合有协同抑制4T1细胞增殖的作用。

图1 和厚朴酚脂质体与阿霉素联合对4T1细胞增殖的影响

2.3 流式细胞分析细胞周期

由表1可见，10μg／ml，12μg／ml and14μg／ml和厚朴酚脂质体处理4T1细胞24 h后，流式细胞术检测细胞周期分布时发现，和厚朴酚脂质体对4T1细胞周期分布的影响不只是减少S期细胞比例，还可将细胞周期阻滞在G0／G1期，从而降低细胞分裂增殖指数。

2.4 Western blot检测周期蛋白表达

由图2可见，对照组细胞与阿霉素处理组细胞Cyclin D1免疫反应信号表达较强，和厚朴酚脂质体处理组信号表达下降，且随浓度增加，信号强度逐渐减弱，联合处理组的信号强度最弱。

表1 和厚朴酚脂质体对4T1细胞周期的影响 （n＝3）

图2 和厚朴酚脂质体对4T1细胞Cyclin D1蛋白表达的影响

3 讨论

阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。在临床上被广泛地应用于乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌、急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病等的治疗，主要的毒性反应有：白细胞和血小板减少，约60%－80%的病人可发生；100%的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常，ST－T改变，多出现在停药后的1－6个月；恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出现红色［6］。

和厚朴酚是从厚朴的根皮、枝皮中提取分离的一种带有烯丙基的联苯二酚类化合物，是厚朴的有效成分之一。研究表明和厚朴酚在体外具有抗新生血管和抗肿瘤的作用，并在体内具有抑制血管肉瘤的作用，且未观察到明显的毒副作用［1－3］。因此我们选用和厚朴酚脂质体和阿霉素联合使用，观察其能否起到协同抗肿瘤作用并且通过降低阿霉素的剂量而减轻其化疗毒副作用。

本实验研究结果显示，在体外和厚朴酚脂质体联合低剂量阿霉素有协同抗乳腺癌的作用，从而降低了阿霉素的使用剂量，产生协同作用可能的作用机制有以下几个方面：

联合增强了针对肿瘤细胞的细胞毒作用

本研究结果显示，和厚朴酚联合阿霉素可以显著抑制4T1细胞生长与增殖，并呈现协同效应（CI＜1），和厚朴酚脂质体浓度为14μg／ml，阿霉素浓度为0.2μg／ml时，协同效应最明显。

联合增强了细胞周期调控和诱导凋亡

细胞周期（cell cycle）是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）与DNA合成后期（G2期）。

我们对实验中的两种药物的协同作用机制进行了进一步的研究，发现10 g／ml、12 g／ml和14 μg／ml和厚朴酚脂质体处理4T1细胞24h后，随着和厚朴酚脂质体浓度的增加，S期细胞数明显降低，大部分细胞被阻滞在G0／G1期，这说明和厚朴酚在抑制细胞增殖的同时，可降低细胞周期中S期细胞的比例，使细胞停滞在G0／G1期，减少分裂期细胞比例。而阿霉素属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，因此两者联合使用增强了抗肿瘤作用。

同时本实验中用 Western blot检测了12μg／ml和14μg／ml和厚朴酚脂质体、0.2μg／ml阿霉素以及12μg／ml和厚朴酚脂质体与0.2μg／ml阿霉素联合处理细胞后cyclin D1的表达情况。结果显示随着和厚朴酚脂质体浓度增加，cyclin D1的表达有所减少，而联合处理组cyclin D1的表达明显降低。而已有研究表明cyclin D1的过表达将使细胞周期素依赖激酶4（CDK4）对Rb的调节失常，细胞周期G1／S期转换时间缩短，进而促进细胞周期进程使细胞呈现无限增殖，导致癌变［7］。所以我们的实验进一步验证了两者协同作用可能的分子机制。

综上所述，本实验采用传统中药中提取的和厚朴酚与细胞毒类化疗药物阿霉素联合使用，体外实验结果显示具有显著的协同效应，降低了阿霉素的用量，从而减轻了其可能的毒副作用，对进一步探索乳腺癌的联合治疗具有一定的意义。

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