H+-ATPase弱化菌株的筛选及其应激性研究

霍贵成，崔 兰，刘 飞,3

（1.乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；3.丹尼斯克（中国）有限公司，江苏 昆山 215300）

随着酸奶品种与营养价值的不断增加，酸奶保质期短的问题亟待解决[1]。酸奶是含益生菌的乳制品，正常发酵结束后，在产品贮存、运输、销售、食用前这一过程中发生后酸化现象时会出现过酸味及感官质量下降，影响酸奶保质期[2]。德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus）具有很强的产酸能力和耐酸性，当外界pH降低时，胞内pH也在降低，德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞质膜中的质子泵（H+－ATPase）能够通过将胞内质子泵出胞外来提高胞内的pH，形成跨膜的pH梯度差，从而使代谢酶的活力不受影响，使其在低pH下仍然能够生长。因此，可以通过改变H+－ATPase的活性来控制酸奶的后酸化。本文利用新霉素来筛选H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变菌株，并对其酸应激和冷应激特性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种：德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS1.9201来源于乳品工业微生物菌种保藏中心（DICC）。培养基：MRS培养基和12%（W/V）脱脂乳培养基。试剂：新霉素（购自Amresco公司）；BCA蛋白质浓度测定试剂盒（购自碧云天公司）；其他化学试剂均为分析纯。

主要仪器：紫外分光光度计DU－800（Beckman公司）；680型酶标仪（美国伯乐）；DHP－9272型电热恒温培养箱（上海－恒科技）；飞鸽离心机GL－20G－Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 H+－ATPase缺陷突变菌株的筛选

将菌株KLDS1.9201用MRS培养基活化2次，第3代在37℃下培养至对数期，取0.1 mL菌液涂布于含有300 μg·mL－1新霉素的MRS平板上，37 ℃培养72～96 h，选取单菌落接种于液体MRS培养基，37℃培养24 h，然后涂布于含有新霉素（300 μg·mL－1）的MRS平板上。37 ℃培养72 h后，选取单菌落接种于 MRS 液体培养基（300 μg·mL－1），37℃培养48 h后测定菌液的pH和600 nm下的吸光值，只有OD600nm＜0.8和pH＞4.2的突变株被用于进一步的研究，将其在含有新霉素的液体培养基中培养一代，再将此突变株置于终浓度10%的灭菌甘油中，在－80℃下保存[3]。

将亲本菌株KLDS1.9201和突变菌株KLDS 1.9201－11以3%接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养，每隔2 h测定发酵液的pH和OD600nm。

1.2.3 菌株酸耐受力的测定

将亲本菌株KLDS1.9201和突变菌株KLDS 1.9201－11接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养10 h，分别取30 mL菌液，10 mL用于制备透性细胞，其余 20 mL菌液 6 000 r·min－1，离心 20 min后，菌泥分别分散到等体积的普通MRS液体培养基和pH 3.0的MRS液体培养基中，37℃作用3 h[4]。作用前后分别取样，采用平板菌落计数法测定活菌数并测定H+－ATPase活力。

1.2.4 菌株冷耐受力的测定

将亲本菌株KLDS1.9201和突变菌株KLDS 1.9201－11接种于MRS液体培养基中，在37℃培养18 h，分别取20 mL菌液，10 mL用于制备透性细胞，其余10 mL菌液，6 000 r·min－1，离心20 min，收集的菌体用等体积的PBS缓冲液洗脱，6 000 r·min－1，离心20 min，重复两次。将收集的菌体分散于10 mL脱脂乳培养基中，混匀后分装于安培瓶中冻干。冻干前后分别取样，采用平板菌落计数法测定活菌数并测定H+－ATPase活力。将冻干好的菌粉接种于10 mL MRS液体培养基中，37℃培养18 h后用于制作冷应激后的透性细胞。

1.2.5 透性细胞的制备

按照Mitsuharu等的方法制备透性细胞，对其中部分步骤进行了修改[4]。分别取亲本菌株KLDS 1.9201和突变菌株KLDS1.9201－11的10 mL菌液在6 000 r·min－1下，离心 20 min，收集菌体，加入500 μL Tris－HCl缓冲液（75 mmol·L－1，含 10 mmol·L－1MgSO4）和50 μL甲苯，用力搅拌直至均匀，37℃静置5 min。将菌悬液至于－80℃中冷冻2 h，取出后再置于37℃中静置5 min，如此反复两次后在6 000 r·min－1下，离心20 min，收集透性细胞，用400 μL Tris－HCl缓冲液悬浮透性细胞，然后将菌悬液迅速冷冻到－80℃中，贮存备用。

与案例教学相比，传统教学有纲可循、有纲可依，只要按教学大纲开展教学，严格把握教学内容，就可满足对基础知识和技能的教学要求。案例教学则要求教师根据不同专业的特点，自行设计教学案例，其方式与内容均不固定，不单一。这既是案例教学的魅力和特征所在，也在客观上加大了教学的难度和不确定性。因此，教师授课过程中应严格、负责地把控课堂教学关，切实保障课堂教学质量，让学生从具体案例中学有所得。

1.2.6 H+－ATPase酶活力的测定

依照 Belli和 Ongol等的方法[5－6]测定酶活，并对其中部分进行了改进。在未添加Na2ATP时，将反应混和液（3 mL）在37℃下温育20 min，然后加入Na2ATP起始反应。在37℃下继续温育10 min后，加入300 μL 0.1 mol·L－1HCl终止反应，随即将反应混合液在冰浴中冷却，将冷却后的反应混合液在室温下以5 000 r·min－1离心10 min，留上清液。然后加入2.1 mL着色剂溶液（300 μL 2.5 mol·L－1H2SO4；300 mol·L－1l 2.5%（W/V）钼酸铵；300 μL 3%（W/V）NaHSO3和1%（W/V）p－甲基氨基苯酚硫酸盐；1.2 mL去离子水），混合后在37℃下温育30 min，随后立即测定OD660nm，将反应混合液中的酶粗提取物替换为 100 μL的50 mmol·L－1Tris－HCl缓冲液（pH 7.0）作为空白。用标准曲线查得或用回归方程式求得试样分解液的含磷量。细胞膜粗提取物中蛋白质的定量采用碧云天的BCA蛋白质浓度测定试剂盒，按照试剂盒的说明书进行操作。H+－ATPase酶的活性用U·mg－1蛋白质来表示，其中每个活力单位定义为1 mg H+－ATPase粗提取物在1 min内分解ATP形成1 μmol的无机磷酸盐[3]。

2 结果与分析

2.1 H+-ATPase缺陷突变菌株的筛选

在本试验中，利用新霉素来筛选质膜H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株。在挑取了200个菌落后，筛选得到1株H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株。命名为KLDS1.9201－11，它的OD600nm和pH分别为0.7647和4.60。新霉素的摄入是一个耗能的过程[7]，质膜H+－ATPase活力高的细菌能够产生足够的能量来摄入新霉素，从而新霉素就可以与30S核糖体亚基结合，抑制细菌蛋白质的合成，也就抑制了细菌在平板上的生长。而质膜H+－ATPase活力差的细菌不能产生足够的能量来摄入新霉素，即具有新霉素抗性，因此可以在含有新霉素的MRS平板上生长。

2.2 亲本菌株与突变菌株的生长曲线

将亲本菌株KLDS1.9201与突变菌株KLDS 1.9201－11接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养，每隔2 h测定发酵液OD600nm和pH，直至24 h为止，结果如图1、2所示。

由图1可知，在培养24 h后，KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的吸光度OD600nm分别为1.0299和0.7024，突变菌株KLDS1.9201－11的细胞密度明显降低。由图2可知，在培养24 h后，KLDS1.9201和KLDS1.9201－11的pH分别为4.05和4.56，突变菌株KLDS1.9201－11的产酸量较亲本菌株KLDS 1.9201也明显降低。质膜H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株具有较低的底物磷酸化水平[3]，因此ATP的产量也随之减少，导致了突变菌株KLDS1.9201－11的低生长速率和弱产酸能力。

图1 KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的生长曲线Fig.1 Growth curve of KLDS 1.9201 and KLDS 1.9201-11

图2 KLDS 1.9201和KLDS 1.9201-11的pH变化曲线Fig.2 pH curve of KLDS 1.9201 and KLDS 1.9201-11

2.3 酸应激对菌株的生长及H+-ATPase活性的影响

2.3.1 酸应激对菌株的生长影响

亲本菌株KLDS1.9201和突变菌株KLDS1.9201－11在酸应激前后的活菌数变化情况见表1。

由表1可知，亲本菌株KLDS1.9201和突变菌株KLDS1.9201－11在pH 3.0的MRS液体培养基中培养3 h后，活菌数与在普通MRS液体培养基中时明显下降。亲本菌株KLDS1.9201下降了86.98%，突变菌株KLDS1.9201－11下降了99.98%，显而易见，突变菌株比亲本菌株活菌数下降明显。

在pH 3.0的MRS液体培养基中，突变菌株比亲本菌株表现出更强的酸敏感性。在酸性环境下，乳酸菌通过质膜H+－ATPase将胞内质子泵出胞外来提高胞内pH，保持胞内pH维持在中性附近，使得菌体自身的代谢正常进行，而突变菌株的质膜H+－ATPase活力较差，不能及时有效的将胞内质子泵出胞外，致使胞内pH过低，影响菌体的生长，因此亲本菌株的酸耐受力比突变菌株强。

表1 酸应激对菌株活力的影响Table 1 Effects of acid stress on the strains activity

2.3.2 酸应激对H+－ATPase活性的影响

采用碧云天的BCA蛋白质浓度测定试剂盒测得的牛血清白蛋白（BSA）蛋白标准曲线见图3。

图3 蛋白标准曲线Fig.3 Protein standard curve

由图3可知，蛋白标准曲线的相关系数为0.9942，说明本标准曲线的线性程度较高，可作为蛋白质浓度测定的标准曲线，用于H+－ATPase活性测定过程中蛋白含量的测定。准确吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL磷标准溶液于100 mL容量瓶中，用超纯水定容。随后按照1.2.6的方法制作磷标准曲线，结果见图4。在无机磷酸盐浓度为0～0.27 mmol·L－1的范围内，相关系数为0.9982，说明本标准曲线的线性程度较高，可作为无机磷酸盐浓度测定的标准曲线，用于H+－ATPase活性测定过程中无机磷酸盐含量的定量。

亲本和突变菌株酸应激前后的酶活变化结果见表2。由表2可知，突变菌株的质膜H+－ATPase活性明显比亲本菌株低，而且在3 h的pH 3.0的酸应激后，酶活都有了明显下降，亲本菌株KLDS1.9201下降了13.33%，突变菌株KLDS 1.9201－11下降了21.15%，说明突变菌株具有更强的酸敏感性。

图4 磷浓度标准曲线Fig.4 Protein standard curve

表2 酸应激对H+-ATPase酶活的影响Table 2 Effects of acid stress on the H+-ATPase activity

在酸奶的后酸化过程中，当pH下降时，质膜H+－ATPase弱化的突变菌株比亲本菌株表现出较弱的代谢水平，使产酸水平下降[8]，从而使酸奶的后酸化速率降低，这对弱后酸化酸奶发酵剂的开发具有重要意义。

2.4 冷应激对菌株的生长及H+-ATPase活性的影响

2.4.1 冻干对菌株的生长影响

亲本菌株KLDS1.9201和突变菌株KLDS 1.9201－11在冻干前后的活菌数变化情况见表3。

冻干是菌种保存的重要手段，可以使菌种的活力得到保证[9]。通过本研究的结果发现，亲本菌株在冻干后活菌数下降了76.71%，而突变菌株只下降了4.88%。在冻干过程中，细菌活性的下降可能主要由以下两个因素引起，一是在预冻时，由于细胞内的水分形成冰晶造成细胞膜损伤而导致部分细胞死亡[10]；二是在冻干过程中，部分细菌可能会由于严重缺水引起蛋白质和细胞内代谢相关酶类的变性而死亡[11]。不同属的细菌对冻干的抵抗力不同，同一属的不同菌种，同种的不同菌株也会表现出对冻干的不同抗性[12]，由此可以得出结论，突变菌株的冷适应性比亲本菌株强。

表3 冷应激对菌株活力的影响Table 3 Effects of cold stress on the strains activity

2.4.2 冻干对H+－ATPase活性的影响

亲本和突变菌株冻干前后的H+－ATPase酶活见表4。

表4 冻干对质膜H+-ATPase酶活的影响Table 4 Effects of cold stress on the H+-ATPase activity

亲本菌株冻干后的酶活力下降了4.27%，由冻干前后亲本和突变菌株的活菌数变化可知，冻干对菌体是有损伤的，其中对亲本菌株的损伤较大，冻干后活菌数下降了76.71%，所以有可能导致其H+－ATPase酶被破坏，从而导致其活力的降低。然而突变菌株的H+－ATPase酶活却上升了29.71%，这可能是由于冻干对突变菌株的伤害作用并不大，突变菌株的活菌数在冻干后仅下降了4.88%就是证明。另外，突变菌株H+－ATPase酶活的增加可能是由于冷应激导致其大量表达，仍需进一步研究。

3 讨论与结论

本研究筛选出一株质膜H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变株，命名为KLDS1.9201－11，以3%接种量，37℃培养24 h后，与亲本菌株KLDS1.9201相比其生长速率较慢，且产酸能力差。在经过pH 3.0的酸应激3 h后，亲本菌株和突变菌株的活菌数分别减少了86.98%和99.98%，H+－ATPase活性分别降低了13.33%和21.15%，突变菌株表现出更强的酸敏感性，这有利于弱后酸化酸奶发酵剂的制作。在冻干后，亲本菌株和突变菌株的活菌数分别减少了76.71%和4.88%，亲本菌株的H+－ATPase活性降低了4.27%，突变菌株的H+－ATPase活性上升了29.71%，说明突变菌株的冷适应性比亲本菌株好，有利于直投式发酵剂的制作过程中活菌数的提高。因此，质膜H+－ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变菌株KLDS1.9201－11能够使酸奶的后酸化速率降低，酸奶的保质期能够延长，可用于弱后酸化直投式酸奶发酵剂的研制。

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