高产γ-氨基丁酸乳酸菌菌株的筛选及诱变育种研究

吴 非，边 鑫，李 良，吴海波，郭 丽

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2.国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨 150050；3.绥化学院生物与食品工程系，黑龙江 绥化 152061）

γ－氨基丁酸（γ－aminobuyric acid，GABA）是一种广泛分布于动、植物中的非蛋白质氨基酸[1]，是哺乳动物脑内的抑制性递质。近年来，随着对GABA的研究不断深入，其降血压[2]、治疗癫痫[3]和焦虑症[4]等众多功效相继被发现，使得GABA受到食品、医疗行业人士的广泛关注。因此，如何提高GABA的含量成为目前国内外的研究热点。目前，GABA主要是通过谷氨酸脱羧酶（GAD）催化谷氨酸转化而成的[5]。研究发现，乳酸菌、霉菌、酵母菌以及其他微生物中含有这种酶[6－8]，可通过提取出的GAD催化谷氨酸转化或微生物发酵来生产GABA。本研究从食用级乳酸菌着手，以豆浆（大豆∶水=1∶8）为发酵基质进行发酵，筛选出GABA的高产菌株，然后利用紫外线对高产菌株进行诱变处理，将得到的突变菌株用含有代谢产物GABA的培养基进行抗性初筛，再依次利用含有1%谷氨酸的改良MRS培养基和豆浆发酵进行复筛及遗传稳定性试验，最终得到稳定高产GABA突变菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌菌株

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）L1，L2，L12，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei），乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp.），均由乳品科学教育部重点实验室提供。

1.1.2 试剂

GABA标准品（美国Sigma公司）；四硼酸钠（天津市光复精细化工研究所）；次氯酸钠（天津富宇精细化工有限公司）；苯酚（沈阳东兴试剂厂）；乙醇（天津市海滨科迪化学试剂有限公司）。

1.1.3 培养基

改良MRS培养基：蛋白胨5 g，胰蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，葡萄糖10 g，乙酸钠5 g，吐温－80 1 g，柠檬酸二胺2 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.1 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水1 000 mL，调pH 5.5。

1.2 方法

1.2.1 豆浆的制备

取大豆加水浸泡6～8 h，沥干后，把泡好的大豆用豆浆机研磨，用纱布过滤。向豆渣中加入适量的纯净水，充分搅拌后，磨滤两次。把3次磨滤制得的浆液混合，再加入适量纯净水混匀，使豆浆中大豆和水的比例为1∶8。然后，用八层纱布过滤4次。

1.2.2 GABA含量的测定方法

本文采用Berthefot比色法[9]测定发酵液中GABA的含量。

1.2.3 乳酸菌菌株的活化

从乳酸菌冻存管中取300 μL菌液，接入10 mL改良MRS液体培养基中，40℃下活化培养24 h，然后，从10 mL改良MRS液体培养基中吸取1.5 mL菌液于50 mL改良MRS培养基中，40℃下培养18 h。再从50 mL改良MRS中吸取3 mL菌液于100 mL改良MRS培养基中，40℃下培养16 h后备用。

1.2.4 高产GABA乳酸菌菌株筛选

将6株活化的乳酸菌菌株接种于改良MRS液体培养基中，40℃静置培养至其稳定期。取7个三角瓶分别倒入等量的豆浆，用封口膜封好，进行巴氏杀菌。杀菌后，取其中一个三角瓶中的样品，测其GABA含量。然后，将不同乳酸菌以3%的接种量分别接到剩下的6个三角瓶中。在40℃恒温条件下发酵12 h。发酵期间每隔1 h取样1次，测定GABA含量，通过GABA含量的比较，获得高产GABA乳酸菌菌株。

1.2.5 高产GABA乳酸菌菌株紫外诱变、抗性初筛及复筛

1.2.5.1 菌悬液的制备

将菌株以3%的接种量接种于含1%谷氨酸的改良MRS液体培养基中，培养至对数期后，取20 mL菌液离心（6 000×g，4℃，15 min），弃上清液，用无菌生理盐水将沉淀溶解，调整菌数约为108cfu·mL－1，即得菌悬液[10]。

1.2.5.2 紫外诱变处理、抗性初筛及复筛

取6 mL菌悬液注入9 cm培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，先打开紫外灯（18 W，距离45 cm）预热20 min，再打开磁力搅拌器，将皿盖取下，用紫外灯垂直照射10、20、30、40、50和60 s。然后，取照射菌液1 mL分别稀释102、103、104、105、106、107。再将不同稀释度的菌液涂布于含适当浓度GABA的改良MRS平板上，同时以未诱变菌株的平板作对照，避光置于40℃的恒温培养箱中培养48 h，进行菌落计数，计算致死率。取致死率在90%以上的单菌落转接于含1%谷氨酸的改良MRS液体培养基中，40℃下静置培养24 h后，测定GABA含量，进行抗性初筛，并计算正突变率。

取GABA含量较高的正突变菌株，分别以3%的接种量接入豆浆中，在40℃恒温条件下发酵，根据发酵过程中GABA最大产量进行复筛，最终获得高产GABA乳酸菌突变菌株。

1.2.6 高产GABA乳酸菌突变菌株遗传稳定性分析

将经过筛选得到的高产乳酸菌突变菌株连续传代12次，每3代取一次菌液进行发酵，测定发酵液中GABA含量，以确定其遗传稳定性。

1.2.7 统计分析

原始数据的整理采用Microsoft Excel 2003进行,每组试验样品均作3个重复进行检测。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵豆浆过程中GABA积累量随发酵时间的变化

将6株乳酸菌培养至稳定期后，进行接菌发酵，通过豆浆发酵过程中GABA积累量筛选出高产GABA乳酸菌菌株。6株乳酸菌菌株的GABA积累量随发酵时间的变化情况见表1。

由表1可见，豆浆本身就含有GABA，含量为0.819 g·L－1。同时发现6株菌株在发酵2 h左右开始生产GABA，当发酵7 h时，乳酸乳球菌乳酸亚种的GABA产量首先到达最大值，为0.702 g·L－1；当发酵8 h时，保加利亚乳杆菌L2和L12的GABA产量达到最大值，分别为1.066和0.609 g·L－1；当发酵9 h左右时，副干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌L1的GABA产量达到最大值，分别为0.755和0.776 g·L－1；而当发酵到10 h左右时，嗜热链球菌的GABA产量才达到最大值，为0.909 g·L－1。通过对GABA产量的比较，可以看出，保加利亚乳杆菌L2的GABA产量最大，因此，可以确定保加利亚乳杆菌L2为高产GABA乳酸菌。

表1 乳酸菌在发酵过程中GABA积累量随发酵时间的变化情况(¯±S)Table 1 GABA accumulation along with the change of fermentation time by Lactobacillus during fermentation

表1 乳酸菌在发酵过程中GABA积累量随发酵时间的变化情况(¯±S)Table 1 GABA accumulation along with the change of fermentation time by Lactobacillus during fermentation

GABA积累量（g·L－1）Accumulation发酵时间（h）Time 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12保加利亚乳杆菌L1 Lactobacillus bulgaricus L1 0.819±0.018 0.831±0.045 0.874±0.100 0.938±0.085 0.996±0.008 1.089±0.011 1.158±0.029 1.265±0.067 1.417±0.092 1.595±0.074 1.381±0.058 1.204±0.071 1.362±0.088保加利亚乳杆菌L12 Lactobacillus bulgaricus L12 0.819±0.078 0.828±0.013 0.849±0.099 0.885±0.063 0.928±0.011 1.012±0.073 1.128±0.023 1.249±0.089 1.428±0.071 1.401±0.055 1.225±0.005 1.323±0.087 1.292±0.051保加利亚乳杆菌L2 Lactobacillus bulgaricus L2 0.819±0.024 0.855±0.141 0.947±0.027 1.074±0.058 1.202±0.011 1.397±0.014 1.539±0.007 1.757±0.042 1.885±0.007 1.830±0.059 1.502±0.072 1.721±0.037 1.639±0.012嗜热链球菌Streptococcus thermophilus 0.819±0.053 0.839±0.071 0.853±0.054 0.879±0.082 0.958±0.014 1.038±0.050 1.113±0.078 1.255±0.095 1.473±0.017 1.607±0.043 1.728±0.018 1.622±0.019 1.490±0.041副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei 0.819±0.085 0.839±0.018 0.858±0.064 0.901±0.162 0.973±0.048 1.107±0.017 1.232±0.021 1.388±0.101 1.485±0.028 1.574±0.009 1.433±0.068 1.299±0.023 1.337±0.176乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.0.819±0.082 0.845±0.012 0.918±0.054 1.002±0.056 1.119±0.027 1.242±0.018 1.381±0.068 1.521±0.019 1.499±0.071 1.273±0.107 1.365±0.054 1.272±0.107 1.259±0.008

2.2 保加利亚乳杆菌L2紫外诱变时间的选择

由于不同菌种对紫外线敏感程度不同，本试验根据保加利亚乳杆菌L2的致死率和正突变率来确定最佳紫外照射时间，结果如图1所示。

图1 紫外线照射时间对保加利亚乳杆菌L2致死率与正突变率的影响Fig.1 Effect of UV irradiation time on death rate and positive mutative rate of Lactobacillus bulgaricus L2

夏江、马燕等研究认为，进行菌株诱变时，一般先选取菌株致死率在70%～95%之间所对应的诱变时间，然后观察其正突变率，正突变率最大值对应的诱变时间即为紫外线最佳照射时间[11－12]。由图1可以看出，保加利亚乳杆菌L2的致死率随着紫外照射时间的增加而逐渐增加，致死率在70%～95%之间所对应的诱变时间为30～60 s。照射时间在50 s时，保加利亚乳杆菌L2的致死率为87%，其正突变率达到最大值，为66.67%，因此，确定紫外最佳照射时间为50 s。

2.3 保加利亚乳杆菌L2紫外诱变的抗性初筛、复筛、二次复筛及遗传稳定性

将保加利亚乳杆菌L2用紫外线处理50 s后，稀释涂布于含GABA的改良MRS平板上，培养48 h，进行抗性初筛。挑取长势较好的30个单菌落接入含有1%L－谷氨酸的改良MRS培养基中发酵进行复筛，获得正突变菌株20株，正突变率为66.67%，正突变菌株的GABA产量见表2。

由表2可知，有三株突变菌株的GABA产量相对较高，取名为L2－4、L2－7和L2－22，在含有1%L－谷氨酸的改良MRS培养基中GABA产量分别为4.235、3.921和4.108 g·L－1，比原菌种分别提高了25.63%、16.32%、21.86%。

将L2－4、L2－7和L2－22三株高产GABA正突变菌株接入豆浆中发酵，每隔1 h测定GABA含量，结果见表3。

表2 紫外诱变后得到的正突变菌株(¯±S)Table 2 Strains of positive mutation by UV mutation

表2 紫外诱变后得到的正突变菌株(¯±S)Table 2 Strains of positive mutation by UV mutation

原菌株和正突变菌株Strain and positive mutative strain L2 L2－2 L2－4 L2－5 L2－7 L2－8 L2－9 L2－11 L2－12 L2－14 L2－15 L2－16 L2－17 L2－18 L2－20 L2－22 L2－24 L2－25 L2－26 L2－27 L2－30 GABA产量（g·L－1）Yield 3.371±0.019 3.526±0.110 4.235±0.043 3.802±0.008 3.921±0.029 3.677±0.205 3.522±0.074 3.618±0.021 3.467±0.253 3.545±0.189 3.555±0.005 3.765±0.052 3.492±0.011 3.564±0.072 3.518±0.015 4.108±0.004 3.665±0.012 3.478±0.085 3.713±0.124 3.648±0.077 3.752±0.067

表3 正突变菌株在发酵豆浆过程中GABA积累量随时间变化情况(¯±S)Table 3 GABA accumulation along with the change of fermentation time by strains of positive mutation during soya bean milk fermented (g·L-1)

表3 正突变菌株在发酵豆浆过程中GABA积累量随时间变化情况(¯±S)Table 3 GABA accumulation along with the change of fermentation time by strains of positive mutation during soya bean milk fermented (g·L-1)

发酵时间（h）Time菌株名称Strain name 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 L2－4 0.819±0.012 0.853±0.052 0.918±0.007 0.975±0.034 1.172±0.032 1.298±0.071 1.427±0.023 1.579±0.013 1.748±0.018 2.213±0.026 1.739±0.045 1.794±0.205 1.721±0.045 L2－7 0.819±0.025 0.844±0.027 0.871±0.021 0.913±0.079 1.089±0.002 1.255±0.017 1.466±0.004 1.762±0.018 1.921±0.082 1.585±0.045 1.649±0.082 1.409±0.098 1.312±0.074 L2－22 0.819±0.019 0.853±0.035 0.909±0.052 0.962±0.047 1.138±0.050 1.241±0.096 1.388±0.037 1.553±0.059 1.792±0.055 2.062±0.021 1.801±0.019 1.757±0.044 1.643±0.031

通过表3可以发现，L2－7发酵到8 h时，产量达到最大值，为1.102 g·L－1；而L2－4和L2－22发酵到9 h时，产量达到最大值，分别为1.394和1.243 g·L－1。3株突变菌株比原菌株的GABA产量分别提高了3.4%、30.77%和16.6%。因此，选取L2－4和L2－22两株突变菌株进行遗传稳定性试验，图2为L2－4和L2－22在传代12次后，每三代的GABA产量变化情况。

由图2所示，突变菌株L2－4在连续传代12次后，GABA产量比较稳定，而突变菌株L2－22的GABA产量明显下降，说明L2－4比L2－22有更稳定的产GABA能力。

图2 紫外诱变筛选的突变菌株产GABA遗传稳定性Fig.2 Genetic stability of mutant strains producing GABA by UV mutation

综上所述，通过紫外诱变获得了稳定的高产GABA突变菌株L2－4，其在1%L－谷氨酸的改良MRS培养基和豆浆中GABA产量分别为4.235和1.394 g·L－1，比原菌株的GABA 产量分别提高了25.63%和30.77%。在相同的试验条件下，对高产GABA突变菌株L2－4的GABA产量进行验证试验，试验结果与该结果相同。

3 结论

a.以豆浆为发酵基质，通过比色法测定豆浆中GABA含量，对6株乳酸菌进行筛选结果表明：保加利亚乳杆菌L2为高产GABA乳酸菌菌株，GABA产量为1.066 g·L－1。

b.对保加利亚乳杆菌L2进行紫外诱变处理，结果表明，最佳紫外线照射时间为50 s。

c.在最佳紫外照射时间下，筛选出一株稳定的高产GABA突变乳酸菌菌株L2－4，其在含有1%L－谷氨酸的改良MRS培养基中的GABA产量为4.235 g·L－1，比原菌株的GABA产量提高了25.63%；同时，L2－4在豆浆中的GABA产量为1.394 g·L－1，比原菌株的产量提高了30.77%。

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