胰蛋白酶水解鲜猪皮的条件选择

冯成利， 党蕊叶， 冯 慧， 刘晓农， 权清转

(陕西省动物研究所, 陕西 西安 710032)

0 引言

胶原是动物结缔组织的主要成分，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、腱等组织器官中，并对各器官正常生理功能的调节起着举足轻重的作用.它是动物机体含量最多的一种蛋白质，其相对分子量高达300 KD.胶原多肽是胶原经水解提纯而获得的，其相对分子量为数千到30 KD[1]，含有18种氨基酸[2,3]，具有水溶性强，粘度低，易被人体吸收等特点[4]，其消化吸收率接近100%，能最大程度地发挥出胶原的各种功能.摄食胶原多肽可促进骨的形成，增强低钙水平下的骨胶原结构，从而提高骨强度，预防骨质疏松症的作用；还可促进胶原的生物合成，改善随年龄增长而导致的人体有关组织的衰老和功能减退；因而对关节症等胶原病具有很好的预防和治疗作用；此外，胶原多肽还具有其他许多特殊的生理功能，如保护胃黏膜和抗溃疡，抑制血压上升等作用[5,6].胶原多肽的生物学功能和药用保健功能等正在被人们所认识，这方面的研究也逐渐成为研究的热点[7].

水解蛋白的方法有化学降解法和生物酶降解法[3,8].化学降解法包括酸法和碱法，酸法水解是强酸在高温下反应，设备要求高，腐蚀严重，产物为单体氨基酸，且色氨酸被破坏；碱法水解使氨基酸大多消旋[9]，即L-氨基酸变成D-氨基酸，利用价值降低；酶法水解条件温和，无环境污染，保留了原料的全部营养成分.本实验利用胰蛋白酶水解新鲜猪皮，对水解条件进行了较为系统的探索，为水解胶原蛋白的研究提供实验基础.

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

1.1.1仪器

(1)HH-SL电热恒温水浴，北京科伟永兴仪器有限公司；

(2)JJ-1定时电动搅拌器，江苏省金坛市正基仪器有限公司；

(3)80-2离心沉淀器，上海医疗器械厂；

(4)pH110酸度计，梅特勒公司.

1.1.2材料与试剂

(1)新鲜猪皮，市售；

(2)食品级胰蛋白酶， 活性4030 u/g,重庆劲康生物技术有限公司；

(3)甲醛、NaOH、酚酞等均为分析纯试剂.

1.2 实验方法

1.2.1猪皮胶原液的制备

将市售的新鲜猪皮，去除脂肪，切成1cm的小方块，用水清洗，再用丙酮室温浸泡3次，每次浸泡4h，回收丙酮，加入一定量的水，加热至125 ℃，蒸煮2.0h，再放至室温备用.

1.2.2水解方法

将不同浓度的猪皮溶液，调pH后，在设定温度下加入胰蛋白酶，混合均匀，并间歇搅拌，反应一定时间后，于沸水浴中灭活5min，待冷却至室温，以4000 r/min，离心30 min，取上清液保存于冰箱，待用[10].

1.2.3水解度(DH)的测定方法

水解度是衡量蛋白质水解程度的主要指标，它指蛋白质被酶水解时所打开的肽键数占总肽键数的百分数.本文采用甲醛滴定法测量溶液的水解度，具体操作按照《生化实验方法与技术》[11]中的方法进行，并按照下列公式计算水解度[12]:

2 实验结果与探讨

胰蛋白酶是从猪、牛、羊等动物胰脏中提取的一种混合酶制剂，主要成分有胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶，另外还含有胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧基肽酶等多种蛋白水解酶.胰蛋白酶只水解赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸残基的羧基所形成的肽键；胰凝乳蛋白酶则优先水解L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的羧基所形成的肽键；而弹性蛋白只有弹性蛋白酶能水解.胰酶中各组分的比例，因提取方法不同而不同，其水解能力也会随组分的变化而变化.

2.1 pH对胰酶水解胶原蛋白的影响

在底物浓度为25%，水解温度48 ℃，胰酶量4%(胰酶重量占新鲜猪皮重量的百分数表示，下同)的条件下，分别调节溶液的pH值为6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，水解时间2h，结果见图1.

图1 pH对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响

胰酶最适pH值因底物的种类、浓度不同而不同，从图1中可以看出：pH在7.0～8.0之间时,胰酶对猪皮的水解效果较好.本试验采用pH为7.5.

2.2 胰蛋白酶量对胰酶水解胶原蛋白的影响

在底物浓度为25%，水解温度48 ℃，pH为7.5的条件下，分别控制溶液的酶量为1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，6.0%，7,0%，8.0%，9.0%，10.0%，水解2h，结果见图2.

图2 酶量对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响

从图2可以看出：胰酶的水解度随酶量的增加而增加，当酶量大于4%以后，增加的幅度变小.考虑酶的效率及生产成本，研究过程选用4%的用酶量.

2.3 底物浓度对胰酶水解胶原蛋白的影响

将700 g新鲜猪皮，按照上面工艺处理，加工成35%的猪皮溶液，再依次配制成35%，30%，25%，20%，15%的溶液，在水解温度48 ℃，pH为7.5，酶量为4%的条件下水解2h，结果见图3.

图3 猪皮浓度对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响

底物浓度的大小对胰蛋白酶水解猪皮胶原蛋白效果的影响比较明显，浓度太大和太小都不利于水解反应的进行.从实验结果及图3可看出，最佳的底物浓度为25%.

2.4 水解时间对胰酶水解胶原蛋白的影响

在底物浓度为25%，水解温度48 ℃，pH为7.5，酶量为4%的条件下进行胰酶水解实验，每15 min测定样品的氨基氮，结果见图4.

图4 水解时间对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响

从实验结果及图4可以看出，胰蛋白酶对猪皮胶原的水解速度开始很快，30 min已完成了80%，随后水解速度逐渐减慢，120 min后溶液的氨基氮达1.27 mg/mL，反应完成了98%以上，随后溶液的氨基氮升幅很慢.本试验采用水解时间为2h.

2.5 温度对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响

在底物浓度为25%，加酶量为4%， pH为7.5条件下，分别控制不同的水解温度进行水解度的测试实验.控制酶解的温度分别为42 ℃、45 ℃、48 ℃、51 ℃、54 ℃，水解2h，结果见图5.

图5 温度对胰酶水解猪皮胶原蛋白的影响

从实验结果及图5可以看出，在51 ℃之前，温度对胰蛋白酶水解猪皮胶原的水解度影响不大，而在48 ℃时，水解度达到最大值，此后随着温度的增加，水解度下降.而在51 ℃之后，水解度下降迅速.酶解温度宜选48 ℃.

2.6 正交实验

根据单因素实验结果，确定最适水解条件，并按正交表L9(34)设计正交表1[13]，实验结果见表2.

表1 正交实验方案

表2 正交实验结果

根据水解度及极差的分析结果可看出，酶量是重要影响因子，猪皮浓度是次要因子， 温度对指标影响最小.正交试验得到的最佳水解条件为pH7.5，水解温度48 ℃，酶与猪皮比40 mg/g，底物浓度25%，水解时间2 h.

2.7 说明

本实验胰蛋白酶水解反应的正交试验所选各因子的水平值，以及单因子实验其它条件控制等，是根据商品酶的说明、供应商的建议，以及以往大量实验的经验选取，并不能完全说明其它商品胰酶水解反应的取值范围.实验所得到的结果和结论，仅代表本实验工艺下所选生产商提供的商品酶，并不代表所有胰酶水解反应条件，但从中可以提供一些实验方法或规律性东西来参考.

3 结论

胰蛋白酶对猪皮的水解，随着胰蛋白酶含量的增加而水解度增加，但胰蛋白酶量大于4%以后，水解速度的增加幅度减小；pH7～8时,胰蛋白酶对猪皮水解的水解度达到最大值；水解反应的开始反应速度较大，30 min后反应速度降低，2 h可使98%的猪皮水解；酶水解反应的酶量是重要影响因子，猪皮浓度是次要因子，温度对指标影响最小；胰酶水解猪皮的最佳条件为：pH7.5，水解温度48 ℃，酶与猪皮比40 mg/g，底物浓度25%，水解时间2 h.在此条件下猪皮的水解度可达16%.

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