一株具抗菌活性的恒山黄芪内生真菌的分离与鉴定

周 凤， 刘 瑞， 张弘弛， 张 睿

(山西大同大学 农学与生命科学学院，山西 大同 037009)

0 引言

内生真菌(endophytic fungi)泛指某些特殊的真菌，它生活史的一定阶段或全部阶段寄生于健康植物的组织和器官内部，而被感染的宿主植物不表现出外在病症[1]，可通过组织学方法从经过严格表面消毒的植物组织中分离.由于内生真菌与宿主植物具有长期的互惠共存共生关系，所以这些真菌代谢产物类型多样，目前内生真菌被认为是筛选新型抗生素的重要资源[2-4].

中国药典规定药用黄芪(Astragalusmembranaceu)为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根[5].恒山黄芪属于蒙古黄芪，又称为正北芪，是我国特有的地道黄芪，其品质和产量位居全国首位.目前药理研究表明，黄芪在心血管、免疫、抗癌、抗衰老以及在血液、肝脏、肾脏等方面有重要的药理作用[6].为了从植物内生真菌中寻找具有生物活性的次生代谢产物，目前已从恒山黄芪中分离得到49株内生真菌并进行了初步筛选[7]，本文将对1株来自恒山黄芪根部的高活性内生真菌进行进一步研究，为全面开发与利用黄芪内生真菌资源提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1植物材料及来源

恒山黄芪全株植物(根、茎、叶)于2010年8月采自山西省北岳恒山阳坡，大约3年生植株，植物样品生长健康无外在病症.

1.1.2培养基

分离培养基为PDA固体培养基；细菌指示菌培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；植物病原菌指示菌用PDA固体培养基.灭菌条件为121 ℃、30 min.

1.1.3指示菌株及来源

革兰氏阳性菌：金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn)；革兰氏阴性菌：大肠杆菌(Escherichiacoli)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa).植物病原菌选用番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、苹果腐烂病菌(Valsamali)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum).以上菌种由西北农林科技大学资环学院微生物实验室提供.

1.2 方法

1.2.1内生真菌的分离纯化

取健康黄芪叶，先用无菌水冲洗干净，晾干水分后，用已灭菌的剪刀将叶片剪成0.5cm×0.5cm小块.按下述步骤进行表面消毒：75%乙醇消毒30s，3%次氯酸钠消毒2min，再用75%乙醇消毒1min，无菌水冲洗2～3次.恒山黄芪根和茎，切成1cm×1 cm的小块，做相同的处理.以上材料分别置于已倒好的PDA培养基上，放置在28 ℃培养3～7d后，观察皿中材料切口处长出菌丝(菌落)，采用顶端菌丝挑取法，选择不同形态的菌落，转入到新配制的PDA培养基中，连续接代几次，即得内生真菌，转接培养并对菌株进行编号，低温保存.分离过程采用组织印迹法[8] 和漂洗液检验法[9]进行灭菌效果的检验.

1.2.2抗菌活性内生真菌的筛选方法

(1)含指示菌培养基的制作

用5mL无菌生理盐水直接冲洗培养好的指示菌斜面，摇匀后，采用血球计数法，将菌悬液的浓度分别稀释到105CFU/mL(细菌)和104CFU/mL(真菌).取1mL稀释后的菌悬液快速加入40～50 ℃融化的9mL培养基中，摇匀后迅速倒入培养皿(ø90)中，冷却后得到含有各指示菌的培养基.

(2)内生真菌筛选(菌饼法[10])

将分离的纯菌种接种于PDA培养基平板上，置于28 ℃的培养箱中培养7d后取出，然后用6mm孔径的打孔器在内生菌菌落边缘切取圆柱形琼脂块(带菌苔)，再用接种针挑取菌饼移植于含指示菌的培养基上，每个指示菌的培养皿中放2～3个内生真菌菌饼.将制好的培养皿置于28 ℃的培养箱中恒温培养2～4d(真菌)，36 ℃的培养箱中恒温培养1～3d(细菌)，观察结果，采用十字交叉法测其抑菌圈的大小.为保证体外活性筛选试验的可重复性，每株内生真菌对每种指示菌做3个重复试验.

1.2.3抗菌活性内生真菌的鉴定

(1)内生真菌的形态学鉴定

对有高活性的黄芪内生真菌进行分类鉴定，分类检索参照文献[11].

菌落形态观察：采用点植法把菌种接到PDA平板培养基，观察真菌菌丝的生长和培养基色泽变化情况，连续观察7d.

菌丝和孢子形态观察：采用制片观察法，先在载玻片上滴加乳酸石炭酸棉蓝染液，用解剖针从菌落边缘处挑取少量产孢子的菌丝，在载玻片上用解剖针分散开菌丝，经染液染色后置于显微镜下观察.

(2)真菌的分子生物学鉴定

真菌DNA提取：将具有抗菌活性的真菌在CM液体培养基中进行发酵培养, 按下述步骤处理：菌体用8层无菌纱布过滤，用无菌水冲洗2次，再分别用PBS溶液和无菌生理盐水各冲洗2次，无菌纱布尽量挤干水分；将菌体加入灭菌研钵中，在倒入液氮同时迅速研磨菌丝体成粉末状，然后按照文献[12]的方法提取真菌DNA.

ITS序列扩增和测定：采用通用引物ITS1, ITS4扩增ITS 序列，按常规的50μL 体系进行PCR扩增.反应结束后取5μL PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测.对检测为好的PCR产物再次进行1%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后切胶回收PCR产物，用pMD218T试剂盒将产物连接到pMD218TVector上，进行测序.测序结果采用BLAST分析.

2 结果与分析

2.1 恒山黄芪内生真菌的分离结果

采用上述方法从恒山黄芪根、茎、叶中共获得49株内生真菌，从黄芪的根部分离得到28株内生真菌，占总菌株的57.14%；茎中分离出15株内生真菌，占总菌株的30.62%，；而叶中只分离出6株内生真菌，占总菌株的12.24%.

2.2 恒山黄芪具抗菌活性内生真菌的筛选结果

采用菌饼法，对分离得到的内生真菌进行抗菌活性筛选.筛选出9株高抗菌活性的菌株，编号分别是：AR02，AR03，AR08，AR14，AR25，AS02，AS05，AS09，AL05.对各指示菌的抗性结果如表1.从表1可以看出，9株内生真菌对所有的测试菌都有抗性，对测试细菌均显示出很强的抑制作用.其中，AR02，AR08和AR25对部分植物病原真菌显示出强的抑制作用.AR08不仅仅抗菌谱最广，而且抗菌活性最强，AR02和AR25次之，因此我们选择编号AR08的内生真菌作为目标菌株.

表1 内生真菌的抑制效果

注：①A表示黄芪，L表示叶部；②-：0<Φ(平均抑菌圈直径) <6 mm； +：6 mm≤Φ<10 mm； ++：10 mm≤Φ<16 mm；+++：16 mm≤Φ<26 mm； ++++：Φ≥26 mm；③B1金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，B2枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis(Ehrenberg)Cohn)，B3大肠杆菌(Escherichiacoli)，B4绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，P1番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，P2白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)，P3辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)，P4烟草赤星病菌(Alternariaalternata)，P5苹果腐烂病菌(Valsamali)、P6西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum).

2.3 菌株AR08的鉴定

菌株AR08的形态特征(图1)：参照《真菌鉴定手册》，对AR08进行分类鉴定：有性孢子不发生，归属于半知菌类；分生孢子梗外露，子实体无一定的界限，绒毛状，归属于丛梗孢目；菌丝表面凝集有色物质，有隔膜，分生孢子梗不分枝，顶端膨大成球状，分生孢子串生，无色，球形或卵圆形，归属于丛梗孢科曲霉属.因此，AR08归属为丛梗孢目Moniliales、丛梗孢科Moniliaceae、曲霉属Aspergillussp.中的一种.

菌株分子生物学鉴定：采用通用的18 S，28 S上保守的序列进行分子生物学鉴定，经过BLAST比对分析，发现该菌与Aspergillusfumigatus的同源性达100%.

结合形态特征和分子生物学鉴定结果，鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，曲霉属Aspergillusfumigatus.

图1 内生真菌AR08的显微形态(×40)

3 结论

本实验从恒山黄芪根、茎、叶中分离得到49株内生真菌.经过抗菌活性测试，筛选出1株抗菌谱广、抗菌活性强的恒山黄芪内生真菌AR08，鉴定为Aspergillusfumigatus.它对金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、番茄灰霉病菌、白菜黑斑病菌、辣椒疫霉病菌、烟草赤星病菌、苹果腐烂病菌和西瓜枯萎病菌均表现出很强的活性，显示出这株内生真菌的开发潜力，其可以成为新的抗生素的重要来源.

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