高效液相色谱法同时测定食品中五种防腐剂的研究

王 丽

(1.西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.宝鸡市产品质量监督检验所，陕西 宝鸡 721000)

0 引言

食品是人类生存的基础，添加适量的防腐剂是防止食品腐败变质最通用的方法；但过量或非法的添加在一定程度上危害人体健康，甚至威胁人类生命[1].因此，食品防腐剂的安全性及检测方法已成为焦点,各个国家的研究者都在努力寻求有效便捷的食品防腐剂检测方法[2-4].

苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸酯类是目前食品工业中应用广泛的添加剂[5].GB/T5009.29-2003记载了果汁等苯甲酸、山梨酸的测定方法为气相色谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法，但检测范围有限[6]；GB/T5009.121-2003采用气相色谱法检测腐乳、酱菜等食品中脱氢乙酸含量，样品前处理繁冗[7].并且国标只能针对某种食品中的一类防腐剂进行测定，而同时测定食品中5种防腐剂的方法也鲜见报道.

现今食品防腐剂的种类及适用范围不断增加，添加方法不断变更，过于单一的检验方法已不能完全满足当前检验工作的需要[8-10].本文采用高效液相色谱法对食品中苯甲酸等5种防腐剂同时进行测定，简化样品前处理程序，提高了检测效率，获得较好的检测效果.

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 仪器

日本岛津高效液相色谱仪(SHIMADZU CLASS-VP l0AT)，美国安捷伦色谱柱(TC-C18)，梅特勒一托利多电子天平(AL104)，江苏昆山超声波清洗器(KQ3200)，天津奥特赛恩斯手提式真空泵(SCIENCE AP-O1)，上海安亭台式离心机(TDL-4)，大龙手动可调式移液枪等.

1.1.2 试剂

标准品：苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯(含量>99.0%，天津科密欧).

试剂：乙醇、乙腈(含量为99.9%，上海国药集团)；乙酸铵、乙酸锌、石油醚、氢氧化钠、亚铁氰化钾等化学试剂(分析纯，天津科密欧)；瓶装纯净水(娃哈哈).

1.2 色谱条件

色谱柱为Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相A相为100%乙腈，B相为0.02 mol/L乙酸铵水溶液，采用梯度洗脱程序，如表1所示；流速：1.000 mL/min；柱温：35 ℃；波长：254 nm；进样量：10μL.

表1 防腐剂的液相色谱的洗脱梯度

1.3 试剂配制

单一标准储备液的配制：称取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯及对羟基苯甲酸甲酯标准品各0.050 0 g，用乙醇溶解并定容至50 mL，终浓度为1 mg/mL， 4 ℃保存.

混合标准溶液的配制：分别用移液枪吸取上述防腐剂单标储备液1 mL于10 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，即得防腐剂混合标准溶液，浓度为100 mg/L.用乙醇逐级稀释至一系列浓度：10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，0.5 mg/L ，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.01 mg/L.

1.4 样品前处理

液体样品：取5 mL样品于50 mL比色管中，调pH6-7后，加入30 mL蒸馏水稀释，如样品富含蛋白质，加入2.5 mL乙酸锌和2.5 mL亚铁氰化钾沉淀蛋白，纯水定容至刻度后再经0.22μm滤膜过滤，收集滤液备用；如样品富含脂肪，则烘干后用氢氧化钠溶液调至碱性，反复加入石油醚脱脂，弃去石油醚层，将剩余物转入容量瓶中，静置分层，取上清液过0.22μm滤膜过滤，收集滤液备用.

固体样品：称取样品5 g粉碎，若样品中蛋白含量低，用水直接溶解并定容，再经0.22μm滤膜过滤，合并滤液备用；若蛋白含量高，则需先加入2.5 mL乙酸锌和2.5 mL亚铁氰化钾来沉淀蛋白，收集上清液再定容至所需刻度.

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱检测条件的优化

2.1.1 色谱柱的选择

min图1 五种防腐剂的标准液色谱图

因所测样品可溶于水相中，结合实验室的条件，选用Agilent TC-C18色谱柱进行分析.

2.1.2 检测器波长的选择

采用二极管阵列检测器分别对上述5种防腐剂的单一标液进行扫描，测得苯甲酸的最大吸收峰在228 nm处；山梨酸的最大吸收峰在260 nm处；脱氢乙酸在234 nm处；对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸乙酯均在254 nm处；而5种防腐剂在254 nm波长处有共同较大吸收峰.故确定254 nm为程序的测定波长.

2.1.3 流动相的选择

分别使用甲醇-水和乙腈-水作为流动相洗脱样品，结果表明在乙腈-水的流动相体系中5种防腐剂可以取得较好的色谱分离效果.

实验选择乙腈-水作为流动相体系，对水相的pH值和缓冲液浓度进行考察，结果表明在水相中添加0.02 mol/L乙酸铵的缓冲盐，可以有效控制流动相的pH波动，使所测5种防腐剂分开.由于苯甲酸与山梨酸的保留时间相近，而苯甲酸、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯之间的性质相差较大，为保持良好的分离度，实验采用梯度洗脱，详情如表1所示.

2.1.4 柱温的选择

实验结果表明，液相色谱检测器的温度对防腐剂的测定结果影响作用较微.但为了使实验结果更精密准确，本方法检测时控制柱温在35 ℃左右.

2.2 方法的评价

2.2.1 色谱分离效果

分别取苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯标液及以上5种防腐剂的混合标准液，按上述色谱条件进行测定，结果如图1所示.结果显示：采用高效液相色谱法，按上述色谱条件进行测定，方法专属性较高，5种防腐剂都达到了较好的分离效果，且在9 min内得到了分离.

2.2.2 线性关系及检出限

将苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的标准液配制成0.01～40 mg/L的一系列梯度浓度，按上述优化后的色谱条件分别测定，采集信号，并绘制出对应线性曲线，计算曲线的相关系数，以信噪比(S/N)等于3作为方法的检出限，测定最低检出限，结果如表2所示.

由表2可以看出，采用高效液相色谱法测定苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯，方法在一定范围内，线性关系良好，相关系数均在0.999以上，方法的最低检出限在0.065～0.601 mg/kg之间，其中对羟基苯甲酸甲酯的最低检出浓度为0.065 mg/kg,苯甲酸的最低检出浓度为0.601 mg/kg.

2.2.3 精密度与准确度

取不含待测组分的同一样品，平行称取3份样，分别加入分高、中、低3个浓度水平的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯以及对羟基苯甲酸乙酯的标准液.按照前处理方法进行处理，每个水平平行测定6次，测其回收率和精密度.结果如表3所示.

表2 防腐剂的液相色谱方法的线性及检出限

表3 检测方法的精密度和准确度

由表3可以看出，采用高效液相色谱法测定苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸乙酯，方法的平均回收率均在90%以上，其中苯甲酸的回收率较低为94.5%，对羟基苯甲酸乙酯的平均回收率最高为97.7%.相对标准偏差在1.64～2.56%之间，其中脱氢乙酸最低为1.64%，对羟基苯甲酸乙酯最高为2.56%.结果基本达到了仪器测定分析法的要求.

2.3 样品测定结果

2.3.1 国标法测定样品中五种防腐剂的含量

随机抽取宝鸡地区市售陈醋、啤酒、果汁、酱油、榨菜五类食品共11个样品，分别为东湖老陈醋、海天威极老陈醋、金威啤酒、汉斯干啤、汇源橙汁、美汁源果粒橙、农夫果园、李锦记老抽、家乐特鲜酱油、口口脆榨菜、乌江牌榨菜，经前处理后，采用国标方法分别测定其中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯的含量，共测定10次，结果如表4所示.

表4 国标法测定食品中防腐剂含量

由表4可以看出，采用GB/T5009.29-2003食品中苯甲酸、山梨酸的测定方法，GB/T5009.31-2003 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定方法，GB/T5009.121-2003食品中脱氢乙酸的测定方法，对上述样品中的防腐剂进行测定，除东湖老陈醋含苯甲酸2.56 mg/kg，李锦记老抽含山梨酸2.95 mg/kg，家乐特鲜酱油含对羟基苯甲酸乙酯1.01 mg/kg外，其它防腐剂均未检出.

2.3.2 高效液相色谱法测定样品中五种防腐剂的含量

采用本文研究的高效液相色谱法同时测定宝鸡地区市售陈醋、啤酒、果汁、酱油、榨菜五类食品共11个样品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯的含量，结果如表5所示.

由表5 可以看出，一些通过国标规定方法测定不出含有防腐剂的样品，通过高效液相色谱同时测定法则可以测定出防腐剂的存在.如通过高效液相色谱同时测定法可以测出样品海天威极老陈醋含有少量的苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸；样品李锦记老抽除含有山梨酸外，还存在部分脱氢乙酸；样品家乐特鲜酱油除含有对羟基苯甲酸乙酯外，还含有山梨酸、脱氢乙酸以及对羟基苯甲酸甲酯；样品乌江牌榨菜含有脱氢乙酸及对羟基苯甲酸乙酯，而上述防腐剂由于其含量小，通过国标法均未测出，由此可见本论文研究的高效液相色谱法与国标法相比，灵敏度更高，检测限更低，本法可以用作食品中是否含有防腐剂的定性检测方法.

表5 高效液相色谱法同时测定食品中防腐剂含量

3 结束语

本文建立了食品中山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯这5种防腐剂的高效液相色谱测定法，并且确定了检测方法的准确度、灵敏度、线性范围.防腐剂检测限在0.078～0.601 mg/L之间，回收率均在90%以上，相对标准偏差小于5%.与国家标准法相比，该法回收率高、重现性好、线性范围合适，且检测限较低，能够实现对食品中这5种防腐剂同时检测目的；实际检测陈醋、啤酒、果汁、酱油、榨菜等食品样品，方法回收率及重现性均很好.因此，作为一种分析测试方法，本法可以作为食品中是否含有以上5种防腐剂的定性判定方法，但是要作为一种通法代替国标法测定食品中防腐剂，尚需大量实验研究及测试.

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